168431. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek előállítására

5 168431 6 telített jégecet használata, mert az ecetsav nyomainak tökéletlen eltávolítása miatt kellemetlen mellékreakciók léphetnek fel a következő ciklusban. Kísérleteink tanúsága szerint például hidrogén-bromid (kloroformmal dolgozva a terc-butiloxikarbonilcsoport pillanatszerűen eltávolítható és száraz éter hozzáadásával a nyers peptid-hidrobromid a reakcióelegyből kicsapható. E nyerstermék esetenként izolálható is, de az éter többszöri cseréjével, a savfelesleg nagyrésze eltávolítható. Ä következő kapcsolást előkészítendő e nyersterméket a kapcsolásoknál említett oldószerek valamelyikében, célszerűen az előző kapcsolásnál használt oldószerben, oldjuk és valamely szerves bázis, célszerűen trietil-amin segítségével a kapcsoláshoz szükséges pH-t beállítjuk. E műveletnél előnyös valamely indikátor például dimetilsárga használata, mely jelzi az adszorptíve kötött sav közömbösítését. E közömbösítéshez természetesen használhatunk OH-ciklusban levő gyantát is. Ily módon az oldatot előkészítettük a következő kapcsoláshoz és vékonyréteg kromatográfia segítségével meggyőződhetünk a védőcsoport-eltávolítás teljességéről, mely a következő kapcsolás, valamint a hibás szekvenciák keletkezésének kiküszöböléséhez elengedhetetlen. Példáink tanúsága szerint esetenként szükség van oldószercserére, hogy biztosítani tudjuk a kirázások jó hatásfokát. Az eljárás fenti leírásából kitűnik, hogy valamennyi ciklus bármely fázisában mód nyílik a reakciósor megszakítására, ha az érzékeny vékonyréteg kromatográfiás ellenőrzés nem teljes, vagy mellékreakciót mutat ki. Különösen gondolni kell erre az oldalfunkciós aminosavak esetében. A vizsgálatok azt mutatták, hogy a szintézis során célszerű az úgynevezett teljes védettség („full protection") elvét alkalmazni, vagyis valamennyi oldalfunkciós csoportot védeni. Jelenleg az oldalfunkciós csoportok védésére a védőcsoportok oly választéka áll rendelkezésre, hogy általános szabályt erre megadni nem lehet, ez minden esetben a szintetizálandó peptid karakterétől és további felhasználásától függ. Az általunk kiválasztott modellpeptidek szintézisénél - melyek leírása a példákban szerepel — oly védőcsoportokat használtunk, melyek a terminális védőcsoport eltávolításának körülményei között stabilak. így az omega-karboxilcsoport védésére a para-nitrobenzilcsoportot, a tirozin és szerin hidroxilcsoportjának védésére az acetilcsoportot, a lizin epszüon-amino-, az arginin quanidinocsoportjának védésére a tozil- illetve nitrocsoportot és végül a hisztidin N ""-csoportjának védésére a dinitro-fenil-csoportot használtuk. Az eljárás leírásából az is kitűnik, hogy a szintetizálható peptidek tagszámának elvi korlátja nincs. Nyilvánvaló azonban, hogy a tagszám növelésével oldékonysági problémák kerülnek előtérbe, melyek megszabhatják a módszer teljesítőképességének határát. Minthogy az eljárás alkalmas ana, hogy tetszőleges időpontban — például a munkaidő befejeztével — a ciklust megszakítsuk és később folytassuk, elvileg, ha a fenti oldékonysági probléma áthidalható, a peptidlánc hosszabbításának nincs akadálya. Ugyancsak egyértelmű a leírásból, hogy a módszer úgy is alkalmazható nagyobb mólsúlyú peptidek előállítására, hogy az ismertetett módon rész-szekvenciákat állítunk elő és ezeket az ismert például azidos vagy aktivészteres technikával kapcsoljuk össze. így például, ha egy 30-as tagszámú peptidet három dekapeptidre bontunk és ezek szintézisét párhuzamosan dolgozva egy nap alatt elvégezzük, a három 5 dekapeptid összekapcsolása további két nap alatt elvégezhető. A példák bizonyítják, hogy a jelen eljárás a fent ismertetett előnyök (tisztítás, ellenőrzés) mellett, az ismert módszerek hatásfokát többszörösen felülmúlja. 10 Találmányunk szerinti eljárást az alábbi példák szemléltetik, anélkül, hogy azokra korlátoznánk magunkat. A példákban használt rövidítések a IUPAC-IUB által elfogadottak [J. Biol. Chem. 247, 977 (1972)]. 15 Az olvadáspont meghatározásokat dr. Tottoli/Büchi, (Svájc) féle készülékben végeztük. A vékonyréteg kromatográfiás vizsgálatokat „Kieselgel nach Stahl" adszorbensen végeztük az alábbi futtató elegyekben: 20 (1) etilacetát - (piridinBcetsav^íz = 20:6:11) = 9:1 (2) etilacetát — (piridin:ecetsav:víz = 20:6:11) = 4:1 (3) etilacetát - (piridin :ecetsav.-víz = 20:6:11) = 3:2 (4) kloroform-metanol = 9:1 (5) kloroform-metanol = 95:5 25 Az előhívás ninhidrinnel és/vagy klór+tolidin segítségével történt. A forgatóképesség mérése Perkin-Elmer 141 készüléken, míg az aminosav-analízisek BioCal 200 típusú készüléken történtek. 30 1. példa BOC-Phe-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Pro-Pro-Ala-Phe-OMe (védett lineáris antamanid) szintézise. 1. ciklus 35 0,44 g (2 mmól) H-Phe-OMe-HCl-t oldunk 12 ml kloroformban és hozzáadunk 0,56 ml (4 mmól) trietil-amint, majd 1,44 g (4 mmól) BOC-Ala-OPFP-t. 15 perces szobahőmérsékleten történő keverés után az oldathoz 4 ml 1 mólos kloroformos N,N-dimetil-40 amino-etilamin-oldatot adunk és 5 perc múlva a kloroformos oldatot kirázzuk 3X12 ml 10%-os citromsav-, majd 1X12 ml 5%-os nátrium-hidrogénkarbonát-oldattal. Szárítás után az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk és a védett dipeptidet 45 (Rjf: 0,85) izolálás nélkül leöntjük 2 ml hidrogénbromiddal telített dioxánnal. 5 perc múlva száraz éterrel kicsapjuk a dipeptid-hidrobromidot (R|: 0,45) az étert cseréljük, majd dekantáljuk és a maradékot oldjuk 10 ml kloroformban. Dimetilsárga jelenlété-50 ben a fölös hidrogén-bromidot közömbösítjük trietilaminnal, majd az oldat pH-ját 7,5-8,5 közé állítjuk. 2. ciklus A fenti kloroformos oldathoz 1,92 g (4 mmól) BOC-Pro-Pro-OPFP-t adunk és 15 perces keverés után 55 4 ml 1 mólos NJí-dimetilamino-etilamin kloroformos oldatát adjuk hozzá. 5 perc múlva az oldatot kirázzuk 3X15 ml 10%-os citromsav- és 2X15 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal. Szárítás után az oldószert eltávolítjuk és a maradék tetrapeptidet (R|: 60 0,85) izolálás nélkül 6 ml hidrogén-bromiddal telített dioxánnal öntjük le. 5 perc múlva száraz éterrel kicsapjuk a tertapeptid-hidrobromidot, (R|: 0,4) az étert cseréljük, majd dekantáljuk. A szilárd maradékot oldjuk 15 ml kloroformban, dimetilsárga jelenlé-65 tében a fölös hidrogén-bromidot trietü-aminnal 3