168431. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek előállítására

3 168431 4 aminosav- vagy peptid-pentafiuorfenilészter felesleggel szerves oldószerrel készült homogén oldatban végezzük, az aktívészter feleslegét az N,N-dimetilamino-etilaminnal híg vizes savoldatban oldható amid alakjában távolítjuk el, majd az adott esetben izolálás 5 nélkül tisztított védett közti termékről a savérzékeny N-termális védőcsoport hidrogén-halogeniddel történő eltávolításával kapott N-terminálisán szabad pepiidet adott esetben izolálás után protonált formájából szerves bázis hozzáadásával felszabadítjuk, és io kívánt esetben a peptidlánc növelését N-terminálisán savérzékeny védőcsoporttal védett aminosav- vagy peptid-pentafiuorfenilészter hozzáadásával folytatjuk. A találmány szerinti eljárás lépései önmagukban ismertek, például az aktívészter felesleg N,N-dimetil- 15 arrdno-etilaminnal történő eltávolítása [Acta Chim. Hung. 44, 61 (1965)] vagy a savérzékeny N-terminális védőcsoport, így a terc-butiloxikarbonil-csoport eltávolítása szerves oldószerben oldott hidrogénhalogeniddel [Helv. Chim. Acta 43, 1910 (I960)] 20 továbbá N-terminálison terc-butiloxikarbonil-csoporttal védett aminosavak szintézise [Laufer D. A. és Blout E. R., J. Am. Chem. Soc. 89, 1261 (1967)]. Például az utóbbi cikkben a H-Val-OCH3-HCl-t egyenértéknyi mennyiségű BOC-Leu—N—hidroxi- 25 szukcinimiddel dimetoxi-etánnal készült szuszpenziójában szobahőmérsékleten reagáltatva az acilezési reakcióidő 2 óra, vagy az idézett Helv. Chim. Acta cikk szerint egy BOC-pentapeptid-nitrofenilészterről a védőcsoport etil-acetátos sósavoldattal történő eítá- 30 volítása 1 órát vesz igénybe. Ezzel szemben a találmányunk szerinti teljes szintézis reakcióideje nem több 2 óránál, és nem szuszpenziót, hanem homogénoldatot alkalmazunk. A találmányunk szerinti eljárás egyik előnye a 35 gyorsasága, mely lehetővé teszi, hogy egy munkanap alatt — a szintetizálandó pepiid karakterétől függően — 7—10 kapcsolás is elvégezhető, másszóval egy nap alatt egy oktapedid, illetve undekapeptid szintetizálható. 40 Az eljárás másik előnye, hogy valamennyi lépésnél mód nyílik az intermedierek tisztítására, valamint a melléktermékek és a fölös reaktánsok eltávolítására anélkül, hogy az intermediereket izolálnánk. Ugyanakkor — szükség esetén — az intermedierek könnyen 45 izolálhatok is, és ebben az állapotban tisztíthatók. Egy-egy ciklus valamennyi fázisában lehetőség van továbbá egyszerű és gyors módszerekkel, mint például a vékonyréteg-kromatográfia, a reakciók lefutását ellenőrizni és szükség esetén a szintézist módosítani. 50 A módszer továbbfejlesztése során mód nyílik a fragmenskondenzáció elvét követve nagyobb mólsúlyú peptidek előállítására. Egy-egy ciklus a következő lépésekből áll: 1. acüezés , 15-30 perc 55 2. fölös aktivészter eltávolítása 5 perc 3. tisztítás 15-30 perc 4. védőcsoport-eltávolítás 15 perc Az acilezések gyors és kvantitatív kivitelezésének alapja a pentafluor-fenilészterek alkalmazása [L. Kis- 60 faludy és mtsai: Proc. 8th Europ. Peptide Symp. 1966 23. old.; J. Org. Chem. 35,3563 (1970); J. Kovács és mtsai: Chem. Comm. 1970, 53.], ami 2-3 ekvivalens aktivészter felesleget használva, a kialakítandó peptidkötés karakterétől függően 10-30 perc alatt kvantita- 65 tív acilezést tesz lehetővé. Az acilező aminosav vagy peptid alfa-aminocsoportjának védésére célszerű oly védőcsoportot használni, mely enyhe savas behatással gyorsan eltávolítható. Az eljárás különösen előnyös kiviteli módja szerint N-terc-butiloxikarbonil-aminosav, illetve -peptid-pentafluor-fenilésztereket használunk [Kisfaludy L. és mtsai, Annalen, 1973, 1421], mert a terc-butiloxikarbonil-védőcsoport szinte pillanatszerűen távolítható el a később részletezett módon. Az első kapcsoláshoz használt C-terminális aminosav karboxilcsoportját oly módon kell védeni, hogy az az egész szintézis során érintetlen maradjon. Az eljárás egy előnyös kiviteli módja szerint a C-terminális karboxilcsoport védésére aíküésztereket használunk. A kapcsolásokat célszerűen vízzel nem elegyedő oldószerekben, mint például kloroform, etil-acetát stb. végezzük, de adott esetben a homogenitás biztosítására használhatók oldószerelegyek is, mint például kloroform-dimetil-formamid stb. Az első kapcsolásnál az aminokomponenst fölöslegben reagáltatva, nincs szükség az aktívészter feleslegének eltávolítására. A kapcsolások befejeztével a homogén oldathoz oly, két bázisos csoportot tartalmazó vegyületet adunk, melynek egyik bázisos centruma könnyen acilezhető, míg a másik nem, és az aktívészter-fölöslegből képződő terméket vízoldhatóvá teszi. Az eljárás szerint a fölös aktívészter eltávolítására N,N-dialkil-amino-etilamint használunk, mely a kísérletek tanúsága szerint a védett aminosavak és peptidek pentafluor-fenilésztereivel pillanatszerűen reagál úgy, hogy a primer aminocsoport acileződik, és a keletkező szubsztituált amidok tercier N-atomjuk révén savas kirázással a reakcióelegyből kvantitatíve eltávolíthatók. A kirázáshoz célszerű híg citromsavas oldatot használni, de adott esetben híg sósavas oldat is használható. E savas kirázások azonban nemcsak az aktívészter-felesleg amidformában történő eltávolítását szolgálják, hanem egyúttal alkalmasak arra is, hogy a nem kvantitatív acilezési reakció esetén visszamaradó reagálatlan aminkomponenst is eltávolítsa. Ez a művelet tehát egyúttal tisztítás is, mely elvileg megakadályozza hibás szekvenciák keletkezését, mely egyébként elkerülhetetlen a következő acilezési lépésnél, ha az előző reakció aminkomponense — hacsak kis mennyiségben is jelen van. Ezért célszerű a savas kirázást többször megismételni. A savas kirázásokat ezután célszerűen híg nátriumhidrogén-karbonát-oldattal történő kirázás követi, mely egyrészt a maradék citromsav, másrészt az aktívészterekből esetleges parciális hidrolízissel keletkező védett aminosavak és peptidek eltávolítását szolgája. E kirázásokat természetesen a szerves oldat gondos szárítása követi, mely a szokásos' szárítószerekkel könnyen kivitelezhető. A fenti reakciók pontosan ellenőrizhetők a reakcióelegy, valamint a vizes extraktumok vékonyréteg-kromatografálásával. Az oldószer eltávolítása után nyert nyersterméket célszerűen izolálás nélkül, savas kezelésnek vetjük alá a védőcsoport eltávolítása céljából. E célra alkalmasak a hidrogén-bormiddal vagy hidrogén-kloriddal telített különböző szerves oldószerek, mint például a kloroform, diklór-metán, dioxán stb. Nem célszerű az egyébként kiterjedten használt hidrogén-bromiddal 2