168378. lajstromszámú szabadalom • Eljárás orgotein kromotográfiás elkülönítésére egy lépésben
13 168378 14 sos szűrőn szűrjük. így üledékmentes oldatot kapunk. A kapott tiszta oldatot' közvetlenül felvisszük DEAE-cellulózt tartalmazó ioncserélő oszlopra (mintegy 40 g súlyú, méretei: 2,5 cm X40 cm, a DEAE-cellulóz típusszáma DE-23, szálas, gyártó cége: W. R. 5 Balston, Ltd., Hardstone, Kent, Nagy-Britannia). Az oszlopot először egy liter 0,005 mólos, pH 6 értékű foszfát-pufferrel mossuk — az oszlop átfolyási sebessége egyébként 200 ml/óra —, majd ugyanezen pufferból 4 literrel mossuk, azonban a pufferhez 0-tól lassan 10 7,5X10~~2 mólra növekvő mennyiségben nátriumkloridot adagolunk. Az eluátum A2 6s és A 280 abszorpcióinak mérése és az eluátum réz- és cinktartalmának atomabszorpciós spektrofotométerrel (Model 353 számú típus, gyártó cég: Instrumentation 15 Laboratories, Inc., Lexington, Mass., Amerikai Egyesült Államok) végzett állandó megfigyelése útján követjük a folyamatot. 1 liter nátrium-kloridot nem tartalmazó és 75 ml, nátrium-kloridot vagy káliumkloridot növekvő mennyiségben tartalmazó eluátum 20 összegyűjtése után, amikor a molaritás elérte a mintegy 0,018 mól értéket, az A26s és az A 28 o abszorpció-értékek alacsony értékre esnek, míg a réz- és cinktartalom hirtelen megnő. Az eluátumot ezután addig a pontig külön gyűjtjük, míg a réztartalom 25 megint a minimumra csökken és a molaritás eléri a mintegy 2,8X 10-2 mól értéket. Az így kapott 550 ml eluátum 240 mg kedvező tisztasági fokú orgoteint tartalmaz. Minél kisebbre választjuk a frakció térfogatát, annál nagyobb lesz az elkülönített orgotein 30 tisztasági foka, de viszont annál kisebb lesz az orgotein termelési hányada. Az így végzett eluálás a 2. ábrán követhető. Igen tiszta orgoteint tartalmaz az eluátum, ha ionerőssége mintegy 0,022 mól ( az összes eluátum- 35 mennyiség 950 ml-jénél). Ezen a ponton mind a réz, mind a cink abszorpciós görbéjén csúcs mutatkozik. Az eluátum 1300 ml-nyi frakciójának 750 ml, 0,04 ß) vezetőképességű vízzel szemben végzett dialízise, majd mikropórusos szűrőn (Millipore típusú, 0,22 /u) 40 végzett szűrés és steril körülmények között végzett liofilizálás, előnyösen a számított mennyiségű orgotein mennyiségére vonatkoztatva kétszeres mennyiségű szacharózzal végzett összekeverés után, teljesen aktív, antigénként nem ható, injektálható orgoteint kapunk, 45 melynek minősége összehasonlítható a jelenleg az állatorvosi praxis céljaira kapható készítményekével. Az oszlop mosása az orgotein eluálása előtt a nem adszorbeálódott és a könnyen deszorbeálható fehérjék eltávolítására végezhető konstans ionerősségű vagy 50 lépcsőzetesen vagy folyamatosan növekvő ionerősségű pufferrel, azaz az oszlop eluálható a mintegy 0,012—0,015 mól ionerősségű, fentiekben ismertetett pufferrel, míg az A265 és az A 2 so abszorpciós értékek a minimumot elérik, majd az orgotein eluál- 55 ható konstans, azaz mintegy 0,02 mól vagy lépcsőzetesen vagy folyamatosan növekvő ionerősségű, azaz mintegy 0,018 mól és 0,028 mól közötti ionerősségű pufferrel. Az oszlop a még adszorbeálódva maradt fehérjéktől megtisztítható mintegy 0,1 mólig vagy 60 annál nagyobb értékig növekvő ionerősségű eluálószerrel. Az 1. példában ismertetett módon eljárva hasonló eredményeket kapunk, ha TEAE-cellulózt vagy dietil- 65 amino-etil-csoportokat tartalmazó térhálósított dextrán gyantát (DEAE-Sephadex) használunk. Az 1. példában ismertetett módon eljárva hasonló eredményeket kapunk, ha kiindulási anyagként a szarvasmarha agyából, veséjéből, lépjéből, tüdejéből, magburkából, hasnyálmirigyéből, csecsemőmirigyéből, beleiből és izomszöveteiből, illetve malacok, lovak, juhok, vagy tyúkok hasonló szöveteiből elkülönített oldható fehérjéket használunk. 2. példa Orgotein elkülönítésére szarvasmarhamájból Az 1. példában ismertetett módon járunk el DE-52 típusú, mikroszemcsézett DEAE-cellulózt használva ioncserélő gyantaként. E gyanta előnye, hogy lehetővé teszi az orgotein élesebb elkülönítését a többi fehérjétől, hátránya viszont, hogy alacsony az átfolyási sebesség használata esetén. Az orgotein frakció elkülönítéséhez használt eluáló gradiens 0,020 és 0,025 mól között mozog (85-110. számú mintavevő csövecskék, mindegyikük térfogata 10 ml), és így jó tisztasági fok orgoteinből 165 mg kapható. Előnyösen a frakciót 0,020 és 0,023 mól között különítjük el (85—100. számú mintavevő csövecskék) hisz a szűkebb frakció nagyobb tisztaságú orgoteint eredményez jelentéktelen orgotein vesztesség mellett. Még szűkebb frakció elkülönítése esetén (88—92. számú mintavevő csövecskék) még tisztább orgotein kapható csökkent termelési hányaddal. 3. példa Szarvasmarhamájból elkülönített előtisztított orgetin Adott esetben az 1. példában ismertetett módon májból elkülönített oldható fehérjék előtisztítási frakcionálásának vethetők alá ammónium-szulfáttal végzett kezelés útján. A mintegy 1600 ml térfogatú, 6,5—6,8 pH-értékét, az extraktum centrifugálása során kapott felülúszó fázis pH-értékű 3 n ammónium-hidroxiddal 7,5-re beállítjuk, majd 25 g/100 ml folyadék arányban szobahőmérsékleten keverés közben az oldathoz szilárd halmazállapotú ammónium-szulfátot adagolunk, így az oldat 40%-ban telített lesz. Közben a pH-értékét 7,5-en tartjuk, majd további 30 percen át keverjük az elegyet szobahőmérsékleten. A nagy mennyiségű csapadékot tartalmazó elegyet ezután centrifugáljuk (20 000 g) 0 C°-on két órán át, majd a felülúszó fázist dekán táljuk, és 4 C°-on pH 5,0 értékre titráljuk 10%-os kénsawal. Ezután az oldathoz 22 vagy 35 g/100 ml oldatarányban szilárd ammónium-szulfátot adagolunk, így az növekvő mértékben, vagyis 70%-ban vagy 80%-ban telített lesz. A nagy mennyiségű csapadékot tartalmazó elegyet ezután 0 C°-on mintegy 1 órán át centrifugáljuk (20 000 g). A kapott felülúszó fázist elöntjük, míg a csapadékot minimális mennyiségű, azaz 100 ml ionmentes vízben újra oldjuk. A kapott oldatot pH 6,0 értékű 0,005 mólos foszfát-pufferré dializáljuk, míg az nem tartalmaz szulfát-ionokat (körülbelül hatszor 4 liter pufferére van szükség). A kapott oldatot centrifugálással (20 000 g) 0 C°-on tisztítjuk, majd a kapott felülúszó fázis pH értékét 6,0-ra beállítjuk. Az így kapott oldat azután az 1. példában ismertetett módon 7
