168378. lajstromszámú szabadalom • Eljárás orgotein kromotográfiás elkülönítésére egy lépésben
15 168378 16 DEAE-cellulózzal töltött kromatográfiás oszlopon végzett elkülönítéshez használható. Orgotein utólagos tisztítása Igen nagy tisztaságú orgotein előállítására molekuláris szitaként ható mikropórusos gélt használunk. Az 1. példában kapott orgotein-liofilizátumot feloldjuk 4 °C hőmérsékletű és 7,5 pH-jú 0,05 mólos TRISZ-hidroklorid pufferben mintegy 70 mg/ml koncentrációban. A puffer továbbá kálium-kloridra nézve 0,15 mólos, glicinre nézve 0,005 mólos, illetve még 0,02% nátrium-azidot, továbbá 10~4 mól/liter koncentrációban réz(H)-iont és 10_s mól/liter koncentrációban cink(II)-iont tartalmaz. Az így kapott oldatot adott esetben centrifugálása után felvisszük, egy Sephadex G-75 márkanevű gyantából készült oszlopra (méretei 3,2 cm, X 966 cm, üres térfogata mintegy 775 ml), amelyet előzetesen úgy kalibrálunk, hogy tiszta orgotein azonos minőségű pufferrel készült oldatát az oszlopra felvisszük, az oszlopot a pufferrel eluáljuk és mérjük az eluátumnak azt a mennyiségét, ami az orgotein eluálódásának megkezdődéséhez, illetve befejeződéséhez szükséges. Ha ezután a tisztítandó orgoteint eluáljuk ugyanezzel a pufferrel, az orgotein az eluálószer azonos mennyiségének átfolyása után kezd eluálódni, mint a tiszta orgotein. Az eluálószer állandó átfolyási sebességét perisztaltikus szivattyúval vagy Marriotte-palackkal biztosítjuk. Az eluátumot 5,4 ml-es frakciókban fogjuk fel, és az eluálás során mérjük az eluátum A265 és A 280 abszorpcióját. Az 50. frakciótól az abszorpciók meredeken emelkednek, és körülbelül a 68. frakcióná csúcsot mutatnak. A 66—73. frakciók tartalmazzák az igen nagy tisztaságú orgotein túlnyomó részét. A 98. frakciónál az abszorpció nullára esik vissza, és úgy marad körülbelül a 116. frakcióig. Az egyetlen jelentős szennyeződés a 118—150. frakciókban észlelhető. Az előző példákban ismertetett módon előállított orgotein tovább tisztítható anioncserélő gyantával végzett ismételt kromatografálás útján. Az oszlop elkészítéséhez mikroszemcsés Whatman típusú DEAE-cellulóz-52-ből (gyártó cég: W R. Balston, Ltd., Hardstone, Kent, Nagy-britannia) 30 grammot összkeverünk 300 ml pH 6,0 értékű 0,1 mólos foszfát-pufferrel. A kapott szuszpenziót állni hagyjuk, majd a felülúszó fázist dekantáljuk. A cellulózhoz 6,2 pH-értékű 0,01 mólos foszfát-puffért adunk, és az elegyet alaposan összekeverjük. A kapott szuszpenziót 10 percen át ülepedni hagyjuk, majd a felülúszó fázist dekantáljuk. A cellulózt ezután a kiindulási pufferrel addig mossuk, míg a mosópuffernek mind a pH-ja, mind a vezetőképességi értéke a kiindulási értékeken (pH 6,0, illetve 0,1 mólnak megfelelő vezetőképesség), konstans marad. Az így kapott szuszpenzióból az abszorbeálódott levegőt és széndioxidot enyhe vákuummal eltávolítjuk, majd közvetlenül ezután a szuszpenziót az oszlopba töltjük. Ha a gyantát pufferekkel vagy polielektrolitokkal egy hétnél hosszabb időn át állni hagyjuk, úgy védőszerként például toluolt kell hozzáadnunk. 1,5 cm átmérőjű üvegoszlopot ellátunk nylon-hálóval, és az oszlop fenékrészére függőlegesen Millipore típusú segéd-szűrőegységet szerelünk. Az oszlopot ezután 6,2 pH-értékű 0,01 mólos nátrium-foszfát pufferrel feltöltjük, majd a kiegyensúlyozott és viszonylag sűrű DEAE-cellulóz-szuszpenziót (az eredeti térfogatának mintegy 120— 150%-a) az oszlop tetején elhelyezett tölcséren keresztül az oszlopba ömlesztjük. Az oszlop alját elzárva tartjuk, míg a 5 cellulóz 1 cm magasan le nem ülepszik az oszlop fenekén, majd az oszlop alját kinyitva szabad folyást engednünk. Az oszlopot addig töltjük, míg a cellulózoszlop 20 cm vastag nem lesz 20—30 perc ülepedési idő alatt. A nehezen ülepedő részecskéket az oszlop 10 alján leszívatás útján eltávolítjuk. Ezután az oszlopot kiegyensúlyozzuk úgy, hogy a kiindulási puffert az oszlopon több órán át vagy egy éjszakán át átáramoltatjuk. Az eluátum pH-értékét és vezetőképességét mérjük, ezáltal biztosítjuk a tökéletes egyensúlyt a 15 gyanta és a puffer között. Az oszlop átfolyási sebességét a puffer hidrosztatikus nyomásával állítjuk be, azaz az oszlop tetejétől 40 cm magasan helyezzük el a puffert tároló edényt, és így az 1,5 cm átmérőjű és 20 cm magas, 30 ml üres térfogatú oszlop átfolyási 20 sebessége mintegy 30 ml/óra lesz. Ezt követően a kiindulási orgoteinből feloldunk 100—200 milligrammot a kiindulási puffer 2—4 ml-jében, és a kapott zöldes színű oldatot óvatosan felrétegezzük a szűrőágy tetejére. Az abszorpció után 25 az orgoteinoldat széles zöld csíkként jelentkezik az oszlop tetejéhez közel. Ezt követően összekapcsoljuk az oszlopot a puffert tároló edénnyel, és megkezdjük az eluálást a 6,2 pH-értékű, 0,01 mólos foszfát-pufferrel. 5 ml-es frakciókat különítünk el Simplex márka-30 nevű (gyártó cég: B. Braun, Melsungen, Német Szövetségi Köztársaság) frakciógyűjtő berendezést használva. Az oszlopot szobahőmérsékleten működtetjük, és az eluátumot jeges vízzel hűtjük. Barnás rózsaszín sáv különül el az oszlopra felvitt minta sávjából az 35 eluáló puffer felvitele után, és ez a sáv gyors ütemben halad lefele az oszlopban, majd 40-50 ml puffer hatására eluálódik az oszlopból. A gyorsan eluálódott szennyeződéseket tartalmazó frakciók összegyűjtése után az eluálást 6,2 pH-értékű, 0,01 mólos foszfát-40 pufferrel folytatjuk mintegy 300 ml össztérfogatig. Miután mintegy 120 ml eluátum összegyűlt, 280 m/u-on enyhén megnövekedett abszorpciójú eluátum hagyja el az oszlopot. A 6,2 pH-értékű, 0,01 mólos foszfát-pufferrel további anyag nem eluálható. 45 Az orgotein eluálását folyamatosan vagy lépcsőzetesen növekvő ionerősségű pufferrel végezzük. Nem tapasztalható jelentős mennyiségű eluálás, míg az ionerősség nem emelkedik mintegy 0,015 mól értékre. Ekkor az oszlop tetejénél maradt zóna világos 50 zöld sávként lefelé vándorol. A teljes eluálást 0,028 mólos pufferrel érjük el. Az orgoteint tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, alaposan dializáljuk (vagyis a dializálást ionmentes vízzel szemben addig folytatjuk, míg a dializátum 55 vezetőképessége nem több, mint az ionmentes vízé, a víz lecserélése után 16^24 órával mérve), majd liofili -záljuk. Az orgotein utólagos tisztítására alkalmazható más módszer is. így az 1. példában ismertetett módon 60 kapott, orgoteint tartalmazó, még nem dializált, mintegy 550 ml térfogatú eluátumhoz (ionerőssége 0,018-0,028 mól) 5 ml 10~2 n réz(II)-acetatot és 5 ml 10~3 n cinksóoldatot adunk, és így az említett fémek koncentrációját az eluátumban mintegy 65 10~4 -re illetve 10 —5 -ra állítjuk be. Ezután az eluá-
