168378. lajstromszámú szabadalom • Eljárás orgotein kromotográfiás elkülönítésére egy lépésben
3 168378 4 Clin. Inv., 40, 2007 (1961); Markowirtz és társai: Anal. Chem., 33, 1594 (1961); Porter és társai: Arch. Biochem. Bioph., 105, 319 (1964); Stansell és Deutsch: J. Biol. Chem., 240, 4299 (1965); ugyanezen folyóiratban 240, 4306 (1965); Stansell és Deutsch: Clin. Chem. Acta., 14, 598 (1966); McCord és Fridovich: J. Biol. Chem., 243, 5753 (1968); McCord és Fridovich: J. Biol. Chem., 243, 6056 (1968); Hartz és Deutsch: J. Biol. Chem., 244,4565 (1969); Carrico és Deutsch: ugyanebben a folyóiratban 245, 723 (1970); és Wood és társai: Eur. J. Biochem., 18, 187 (1971). A fenti közleményekből ismertté vált tehát, hogy az orgotein fehérjekomponenseinek családjához tartoznak az úgynevezett metallo-fehérjék, azaz fémtartalmú fehérjék, minthogy az orgotein kifejezett peroxid-diszmutáz hatást mutat, továbbá az orgotein kapcsolatát az említett enzim emlősök esetén található formájával szintén megállapították. Az említett metallo-fehérjék az irodalmi adatok szerint szintén igen nagy peroxid-diszmutáz (sodase) aktivitást mutatnak. Lásd McCord és Fridovich: J. Biol. Chem., 244, 6176 (1970); valamint ugyanezen folyóiratban 246,2875(1971). A 687 828 számú belga szabadalmi leírás és az 1 160 151 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás több lépéses eljárásokat ismertet orgotein állati szövetekből, így például szarvasmarha májából végzett elkülönítésére. A 3 687 927 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban olyan továbbfejlesztett eljárást ismertetnek orgotein elkülönítésére, ahol szarvasmarha májából és más állati szövetekből végzik az elkülönítést, de számos műveleti lépést elhagynak és a termelési hányad lényegesen megnő. A 3 579 495 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban orgotein elkülönítésére ismertetett eljárás szerint az orgoteint vörös vérsejtekből több lépéses eljárásban különítik el, amikor is a hemoglobin eltávolítására előzetes oldószeres kezelést és melegítést alkalmaznak, míg a termelési hányad a teli vörös vérsejtekre vonatkoztatva mintegy 0,01%. A fentiekben ismertetett egyes irodalmi közleményekben beszámolnak DEAE-cellulózzal végzett kromatográfiás tisztítási lépésről mint az orgotein szarvasmarhamájból és más állati szövetekből végzett elkülönítésére szolgáló több lépéses eljárások egy műveleti lépéséről. Carrico és szerzőtársai [J. Biol. Chem., 244, 6087-6093 (1969)] által ismertetett eljárás során extrahált oldható fehérjék elegyét három kromatográfiás tisztítási lépésnek, valamint az egyes lépések között dialízisnek ésSephadexG—75 márkanevű (gyártó cég: Pharmacia, Svédország) gélszűrőn végzett gélszűrésnek vetik alá. Ez az eljárás laboratóriumi méretekben ugyan kivitelezhető, a gyakorlatban azonban nem vált be, hiszen az összesített termelési hányada csak 0,0065% volt. A fentiekben ismertetett irodalmi közleményekben többek között ismertetnek DEAE-cellulózzal végzett kromatográfiás tisztítási lépést orgotein vörös vérsejtekből végzett elkülönítésére szolgáló több lépéses eljárás részeként. A legegyszerűbb ismertetett eljárások során a vörös vérsejtekből oldószeres kicsapással eltávolítják a hemoglobint, majd az így kezelt vörös vérsejteket kálium-hidrogén-foszfáttal és acetonnal frakcionálják. Az elroncsolt szarvasmarhavörösvérsejtek frakcionált oldható fehérjéinek egy részét pH 7,4 értéken kromatografálják. így 3 liter ép sejtből 190 mg orgotein különíthető el, mely mennyi-5 ségnek a peroxid-diszmutáz aktivitása 3300 egység/mg (összesített termelési hányad: 0,006%; az orgotein kihozatala 60%). Bár az ismertetett eljárás laboratóriumban megvalósítható, a gyakorlatban alkalmatlannak bizonyul. Például egy kilogramm orgotein előállí-10 tásához több mint 7500 liter kloroformra, 4500 liter etanolra, 7000 kg kálium-hidrogén-foszfátra és 5000 liter acetonra lenne szükség, ha az eljárást üzemi méretekben változtatás nélkül megvalósítanánk. Azt találtuk, hogy a hemoglobin elkülönítésére 15 használt oldószer a szénsav-anhidráz elkülönítésére használt kálium-hidrogén-foszfát, valamint az orgotein kicsapására használt oldószer elhagyható, és ezáltal az eljárás a gyakorlatban üzemi méretekben megvalósítható. 20 A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás orgotein kromatográfiás elkülönítésére egy lépésben állati vagy emberi szövetekből vagy vörös vérsejtekből az orgotein és más, pufferekben oldható fehérjék elegyének kromatográfiás elkülönítése útján, ahol a fehér-25 jék elegyét vízzel vagy 7-9, előnyösen 7,5—7,8 pH-jú pufferrel készült, 0,01 mólnál kisebb ionerősségű vizes oldatban gyengén bázikus csoportokat tartalmazó ioncserélő gyantából álló oszlopra felvisszük, a gyantán az orgoteint és az elegy fehérjéinek egy részét 30 adszorbeáljuk, a gyantáról az adszorbeálódott fehérjéket a felvitelhez használt vizes oldatnál nagyobb ionerősségű vizes eluálószerrel eluáljuk, és az orgoteint az eluátumból elkülönítjük. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a 35 kromatográfiás elkülönítést 5,5 és 6,5 közötti pH-értéken végezzük, az oszlopból az adszorbeálódott fehérjék egy részét, éspedig a fehérjék kiindulási elegyében jelen levő hemoglobint és szénsav-anhidrázt 0,02 mól alatti ionerősségű vizes eluálószerrel eluál-40 juk, és ezután az oszlopból az adszorbeálódott fehérjék másik részét 0,02 mól és 0,03 mól közé eső ionerősségű vizes eluálószerrel eluáljuk, miközben mérjük az eluátum A265 és A 280 abszorpciója közül legalább az egyiket, valamint az eluátum réz- és 45 cinktartalma közül legalább az egyiket, és ha állati vagy emberi szövetekből elkülönített fehérjék elegyét használjuk kiindulási elegyként, akkor a 0,02 mól és 0,03 mól közé eső ionerősségű eluátumból elkülönítjük azt az orgoteint tartalmazó frakciót, amelynek 50 maximális az egyik nemionos kétvegyértékű fémtartalma, valamint minimális az A2 6s vagy A 2 so abszorpciója, és ha kiindulási elegyként emberi vagy állati vörös vérsejtekből elkülönített fehérjék elegyét használjuk, akkor azt az orgoteint tartalmazó frak-55 ciót különítjük el, amely az A265 /A 28 o arány maximum irányába történő emelkedésével kezdődik és az A2 6s |A 2 8o arány, valamint a réz- vagy a cinktartalom csökkenésével fejeződik be. A találmány szerinti eljárás során lényegében tiszta 60 orgotein különíthető el magas termelési hányaddal elroncsolt vörös vérsejtekből egyetlen kromatográfiás tisztítási lépésben, szerves oldószerrel vagy sóval végzett elő- vagy utótisztítás nélkül. A találmány értelmében bár a vörös vérsejtek oldható fehérjéinek 65 legalább 96%-a hemoglobin, és a további 4% fehérje 2
