168378. lajstromszámú szabadalom • Eljárás orgotein kromotográfiás elkülönítésére egy lépésben

168378 5 6 legalább 70%-a szénsav-anhidráz, mindként anyag ugyanazon a műveleti lépésben szeparálható az orgoteintől, amelyben az orgoteint lényegében tiszta állapotban elkülönítjük. Azt találtuk tehát, hogy gyógyászatilag elfogadható tisztaságú orgotein állítható elő állati szövetek vagy vörös vérsejtek oldható fehérjéinek elegyéből egyetlen kromatográfiás tisztítási lépésben, miáltal a találmány szerinti eljárás rendkívül jól használható a gyakorlatban. A jelen eljárás egyszerűségét és gazdaságosságát bizonyítja, hogy a teljes eljárási- és anyagköltség az eddig ismert eljárások gyakorlatilag legalacsonyabb hasonló költségeinek egytizede. A találmány szerinti eljárás kiindulási anyaga vagy állati szövetekből extrahált pufferekben oldható fehérjék elegye vagy vörös vérsejtek oldható fehérjéinek, így többek között a hemoglobinnak és a szénsavanhidráznak az elegye. Az „állati szövet" kifejezés alatt szervi, izomzati vagy hasonló szöveteket értünk. Kiindulási anyag a vér is, valamint a vér bármely olyan frakciója, mely az orgoteinnél jóval nagyobb mennyiségben tartalmaz más oldható fehérjéket, így hemoglobint és szénsavanhidrázt, miáltal az egyes frakciók feldolgozása során eltérő technikai műveleteket szükséges végezni. Állati szövetek közül előnyösnek bizonyult a máj, különösen a szarvasmarha mája, minthogy orgoteintartalma magas. Használhatók azonban más szövetek is, így vese, szív, agy, lép, belek, izmok, herék, nyaki mirigyek, tüdő, nyelv, csecsemőmirigy és hasnyálmirigy. Pufferekben oldható, orgoteint tartalmazó fehérjék elegyének forrásaként előnyösen számba jöhető állatfajták a szarvasmarha, a tyúkfélék, a sertés és a ló. További számba jöhető állatfajták a juh, a kecske, a nyúl, a kutya, a patkány stb. Emberi szövetek is használhatók. Különösen előnyösnek bizonyultak a szarvasmarha szövetei. A pufferekben oldható, orgoteint tartalmazó fehérjék kiindulási elegyét állati szövetek és a kiválasztott vizes extrahálószer alapos összekeverése útján állítjuk elő. Az oldható és a nem oldható fehérjék elválasztására az állati szövetet a lehető legalaposabban felaprítjuk. Például a szövetet húsdarálóban előzetesen péppé dolgozzuk fel, majd alaposan összekeverjük a kiválasztott extrahálószerrel, például nagysebességű keverőberendezésben. Az állati szövet és az extrahálószer egymáshoz viszonyított aránya nem kritikus paraméter, és ezt az arányt elsősorban az elegy fizikai kezelhetősége határozza meg. Túl alacsony arány esetén azonban valamelyest csökken a szövetekből extrahálható orgotein termelési hányada és iszapszerű keverék képződik, melyet nehéz elkülöníteni és ezáltal a folyékony fázis kolloid anyagok feles mennyiségét tartja vissza, amelyek viszont eltömhetik a kromatográfiás oszlopot. Túl nagy arány esetén sem jelentkeznek előnyök, minthogy az extrahált fehérjék oldata felhígul, és ezáltal nagy térfogata következtében kezelése nehézkes. Általában az extrahálószer és az állati szövet aránya mintegy 2 : 1 és 4 : 1, előnyösen 2,3 : 1 és 2,8 : 1 arányértékek között mozog. Az extrahálószer lehet víz, víz és vízzel elegyedő szerves oldószerek, így például aceton, metanol és etanol elegye, vagy előnyösen viszonylag kis ionerősségű, azaz 0,01-0,05 mólos, különösen előnyösen mintegy 0,02-0,03 mólos pufferoldat. Bár az extrahálószer pH-értéke mintegy 4 és 9 között változhat, 5 gyengén lúgos pH, azaz 7 és 9 közötti pH, előnyösen mintegy 7,5-7,8 pH-érték előnyösnek bizonyul, különösen ha a kezelt állati szövet a máj. Ha az állati szövetek extrahálószereként vagy az elroncsolt vörös vérsejtek hígítószereként pufféról da -10 tot használunk, bármely olyan puffer használható, melynek pH-értéke a fentiekben említett pH-tartományba esik. Ilyen pufferek például a foszforsav, a bórsav, a dimetil-arzinsav, a citromsav, az ecetsav, a borostyánkősav és a maleinsav sói, a kollidin-hidro-15 klorid TRISZ-glicin-hidroklorid elegy, stb. Lásd továbbá Gomori, J. : „Methods in Enzymology", 1. kötet, 136-146 (1955) c. könyvét, különösen az e könyvben említett 5—8. és 10—18. puffereket. Előnyös puffer, különösen máj extrahálására, a TRISZ-20 glicin puffer, melynek pH-értéke 7,5. A puffer tartalmazhat más sókat, valamint más anyagokat extrahálóképességének megváltoztatása céljából. Az extrahálószer ionerősségének növelésére használhatók többek között a nátrium-klorid, a 25 kálium-klorid, a mangán (Il)-szulfát és más nem pufferoló sók. Oldható szacharid, így például glükóz, szacharóz stb. adagolható az extrakció elősegítésére, minthogy az említett anyagok a puffert még szelektívebbé teszik. 30 A szuszpendált szövetrészek és a vizes extraktum elegyét ismert módon különíthetjük el, így nyomás alatt vagy vákuumban végzett szűréssel, valamint centrifugálással, előnyösen az utóbbi művelettel. Az extraktum adott esetben tisztítható szűréssel 35 va

Sy bármely e célra ismert módszerrel. Á találmány szerinti eljárás során számos állatfaj vörös vérsejtjeinek oldható fehérjéi használhatók. Alapvetően olyan vér használható, amelyben az orgotein izoelektromos pontja fehérjék elegyében legalább 40 1 pH-értékkel különbözik a szénsav-anhidráz izoelektromos pontjától. Előnyösek olyan orgoteint tartalmazó vörös vérsejt eredetű oldható fehérjék, amelyek izoelektromos pontja mintegy 4,5-5,5. Alkalmasnak bizonyulnak a szarvasmarha, a tyúk, valamint 45 az ember vörös vérsejtjei. Alkalmas továbbá többek között a nyúl, a majom és a patkány. Különösen előnyösek azonban a szarvasmarha vörös vérsejtjeiből származó oldható fehérjék. 50 A vörös vérsejtek — melyek számos emlős vérének átlagosan mintegy 35-45 térfogat%-át és mintegy 39-50 súly%-át alkotják — a vérplamzától centrifugálás útján különíthetők el, a gravitáció hatására is végbe mehet azonban ez az elkülönülés. A tömör 55 sejtekhez tapadó plazma eltávolítható az elkülönült sejtek mosása és újbóli centrifugálása útján. A mosáshoz olyan molaritású fiziológiás konyhasó-oldatot vagy puffert használunk, hogy a sejtek korai elroncsolódása elkerülhető legyen. 60 A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja értelmében a vörös vérsejtek elroncsolására az úgynevezett szonifikálási eljárást, azaz az ultrahanggal végzett elroncsolást alkalmazzuk. Ennek az elroncsolási módszernek az az előnye, hogy a 65 fehérjék kiindulási oldatának a térfogata nem nő, 3