168366. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vérammónia mennyiségi meghatározására és reagens a meghatározás elvágzéséhez
168366 3 4 Analyse — H. U. Bergmeyer kiadás - 1. kötet 607. oldal, 2. kiadás, Verlag Chemie Weinheim, 1970) a glutamátdehidrogenáz sokkal gyorsabban reagál NADH-val, így a már itt fellépő nem kívánt lassú i reakcióra való tekintettel NADPH már ez okból sem 5' látszik használhatónak. Meglepő módon azt találtuk i azonban, hogy a meghatározás megfelelő reakciókörülmények között NADPH jelenlétében nagyon gyorsan elvégezhető és másrészt a NADPH mellékreakciói ! olyan elenyészőek, hogy csak minimális nemfajlagos 10 extinkcióváltozások lépnek fel, amelyeket gyakorlatilag nem kell figyelembe venni. Az NADH alkalmazásával dolgozó ismert eljárásnál egy 15-20 perces előinkubációt kell beiktatni. Ennek az előinkubációs időnek az eltelte után sem 15 fejeződnek be nemfajlagos mellékreakciók és átfedik a tulajdonképpeni meghatározási reakciót, ha 20 perc elteltével a glutamindehidrogenázt a meghatározó elegyhez hozzáadjuk. A találmány szerinti eljárásnál ezzel szemben az előinkubáció szükségtelenné válik és 20 egy végső értéket már 5 perc után el lehet érni. Emellett figyelembe kell venni azt, hogy normális plazmában az előforduló NH3 -koncentráció olyan kicsi, hogy viszonylag nagy mennyiségre, körülbelül 0,5 ml-re van szükség ahhoz, hogy egy pontos 25 meghatározáshoz elegendő extinkcióváltozást kapjunk az optikai vizsgálat során. Mivel fehérjementesítés vagy a fehérje denaturálása nem történik meg, nagyon nagy mennyiségű enzim és szubsztrátum van jelen, amelyeknél 'NADPH-val való reakció lenrie30 várható. Különösen kedvezőnek bizonyult a találmány szerinti eljárásnak ADP (adenozindifoszfát) jelenlétében való végrehajtása. Azt találtuk, hogy ezáltal a glutamátdehidrogenáz stabilizálása és aktiválása érhető el, 35 amely a meghatározás különösen gyors lefutását teszi lehetővé. A találmány szerinti eljárást semlegestől a gyengén lúgosig terjedő pH tartományban hajtjuk végre, mivel a glutamátdehidrogenáz aktivitása itt mutatja a leg- 40 kedvezőbb értékeket. Egy megfelelő tartomány 7 és 9,5 pH között van. Előnyösen erősebben alkalikus tartományban dolgozunk, mint az eddig ismert eljárásoknál dolgoztak, különösen előnyös a 8,5 és 8,7 közötti pH-tartomány. Pufferanyagokként itt az 45 adott tartományban hatásos puffereket, így foszfát-puffért, trisz-puffert [trisz(-hidroxi-metil)-amino- j metán] és trietanolamin-puffert alkalmazhatunk. | A reakcióban résztvevő anyagok koncentrációja ugyanabban a tartományban lehet mint az ismert 50! eljárásoknál. Az a-ketoglutarát koncentrációja a reakcióelegyben célszerűen körülbelül 5 mmól és körülbelül 20 mmól között van, a glutamátdehidrogenázt célszerűen 1 és 20 U|ml reakcióelegy közötti mennyiségben adagoljuk. A •pufferkoncentráció is 55 viszonylag széles körben ingadozhat és célszerűen 0,05 mól és 0,25 mól között változik. Az előnyös kiviteli mód esetében, amelynél ADP-t adagolunk, azt az anyagot olyan mennyiségben visszük be az elegybe, hogy a koncentrációja körülbelül 0,1 mmól és 2 60 mmól között lesz. A találmány szerinti eljárást, amint már említettük, a plazmában, azaz a vörösvérsejtektől rriár mentesített vérben, hajthatjuk végre. Az eljárás kivitelezése úgy történik, hogy az a-ketoglutarát-tartalmú 65 pufferoldathoz NADPH-t és adott esetben ADP-t adunk, utána a plazmát hozzákeverjük, az extinkció kiindulási értékét megmérjük, az enzimet hozzátesszük és 5—10 perc elteltével az extinkcióváltozást meghatározzuk. A találmány szerinti eljárás nemcsak egyszerű és gyorsan elvégezhető, hanem nagy pontossága miatt is kitűnik. Ellenőrző kísérleteket is végeztünk, amelyeknél 29 plazmapróbát ammónium-kloriddal 160,0 jumól végső koncentrációra állítottunk be. A meghatározás átlagosan 160,8 jumól-t adott, amely +0,5%-os hibának felel meg. A találmány kiterjed továbbá a találmány szerinti eljárás kivitelezésére szolgáló reagenskombinációra is. Egy ilyen reagenskombinácio 1. a-ketoglutarátot 7—9,5 pH-jú pufferben, 2. glutamátdehidrogenázt és 3. NADPH-t tartalmaz egymás mellett használat előtt összekeveretlen állapotban. Az 1. és 3. alkotórészek összekeverhetők az eltarthatóság időtartama hűtés közben ekkor azonban csak körülbelül 3—4 hét. A találmány szerinti reagenskombináció előnyösen a következőkből áll: 1. 0,05-0,25 mól trietanolamin-puffer, 8-9,0 pH tartomány, 15—50 mmól ct-ketoglu,tarát, 0,5-5 mmól ADP és adott esetben 2-30 mmól alkáliazid, 2. 5-50 U glutamátdehidrogenáz, 3. 0,1-1 /xmól NADPH, előnyösen valamely stabilizátor vagy stabilizálóelegy jelenlétében. A találmány szerinti reagens keretében alkalmas stabilizátor az NADPH számára a szérumalbumin egymagában vagy nátrium-hidrogén-karbonáttal és dextránnal való kombinációban. Különösen előnyös 0,1-0,5 jumól NADPH, 10-50 mg szérumalbumin, 1-5 mól NaHC03 és 5-60 mg dextrán alkotórészek közül 3-nak a kombinációja. Ez a találmány szerinti reagens a megadott mennyiségben egyetlen meghatározásra szolgál. Ezek többszöröséből készült reagenssel nagyobb számú meghatározást is végezhetünk. A találmány szerinti eljárás nemcsak a vérben, illetve plazmában levő ammóniának, hanem más ammóniaképző anyagoknak, például karbamidnak, a meghatározására is alkalmas. Az utóbbi esetben a reakcióelegyhez, illetve reagenshez csupán még ureázt adhatunk, illetve glutamátdehidrogenáz és ureáz elegyét alkalmazzuk. A következő példák a találmány további megvilágítására szolgálnak. 1. példa Olyan reakcióelegyet alkalmazunk, amely 0,15 mmól 8,6 pH-értékűtrietanolamin-hidrokloridot, 20 mmól a-ketoglutarátot 1,5 mmól ADP-t, 15 mmól nátrium-azidot és 0,3 mmól NADPH-t tartalmaz. A következőkben két 10 mm rétegvastagságú küvettába a következőket adagoljuk be: 2
