168297. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dihidroaunomicin előállítására
5 168297 6 1. példa Következő összetételű táptalajt állítunk elő: sörélesztő autolizátum por 5 g 5 káliumdihidrogénfoszfát 1 g dikáliumhidrogénfoszfát 1 g desztillált víz 90 ml A táptalaj pH-ját n nátriumkarbonát-oldattal 10 6,9-re állítjuk be, és 122°-on 20 percig sterilizáljuk. Lehűlése után literenként 50 g glukózt tartalmazó 100 ml steril oldatot adunk hozzá. 300 ml-es lombikban levő 50 ml 6,9 pH-jú táptalajt beoltjuk 2,5 ml Corynebacterium simplex 15 ATCC 6946 törzs tenyészettel, és percenként 220 fordulattal keverve, 30°-on 24 óra hosszat inkubáljuk. A jól fejlődött tenyészet pH-ja ekkor 7,45. Hozzáadunk 1 ml vizes 10 mg/ml koncentrációjú daunorubicin-hidroklorid oldatot. A redukciót ez- 20 után 24 óra hosszat ugyanolyan körülmények között és ugyanolyan hőmérsékleten végezzük, mint az inkubálás folyamán. A redukció befejeztekor a tenyészet pH-ja 8,4. Ekkor a pH-t 25 ml borátpuffer hozzáadásával 9-re 25 állítjuk be, majd a keveréket 50 ml metilénklorid és n-butanol 80 :20 térfogatarányú elegyével kétszer extraháljuk. A szerves kivonatokat vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk. 30 Az extrakcióval kapott kitermelést (90%) spektrofotometrálással határozzuk meg oly módon, hogy 480nm-nél mérjük az abszorpciót, és összehasonlítjuk a daunorubicin ugyanilyen körülmények között mért abszorpciójával. 35 A 20798 RP antibiotikum termelést a szerves kivonatoknak kovasvgélen való vékonyréteges kromatografálásával határozzuk meg. A vékonyréteglemezre felvitt kivonat térfogata a spektrofotometrálással meghatározott színes anyag mennyi- 40 ségétől függően 1 és 10 pg között van. A lemezeket metilénklorid-hangyasav-metanol 80 : 17 : 3 térfogatarányú elegyével fejlesztjük ki, és így jól elkülöníthetjük a daunorubicint és a 20798 RP antibiotikumot. A kapott termékek Rf értékeit 45 ugyanilyen körülmények között kromatografált hiteles minták Rf értékeivel hasonlítjuk össze. A 20798 RP antibiotikum termelését mennyiségileg értékelve kitűnik, hogy a Corynebacterium simplex ATCC 6946 a daunorubicint 73% kitermeléssel 50 redukálja 20798 RP-antibiotikummá (az alkalmazott daunorubicinre számítva). 2. példa 55 a) Redukáló tenyészet 800 literes fermentáló kádba betöltjük a következő anyagokat: 60 sörélesztő autolizátum por 2,50 kg káliumdihidrogénfoszfát 0,50 kg dikáliumhidrogénfoszfát 0,50 kg csapvízzel kiegészítve 460 literre 6 $ Az így kapott folyékony táptalaj pH-ját 225 ml lOn nátriumkarbonát-oldat hozzáadásával 6,90-re állítjuk be, majd 40 percig 122°-os gőz átbuborékoltatásával sterilizáljuk. A sterilizálás folyamán a vízgőz kondenzálása következtében a folyékony táptalaj térfogata lehűlése után 494 liter lesz, ekkor 2,5 kg glukóz-monohidrátot tartalmazó 6 liter vizes oldattal 500 literre egészítjük ki. A folyékony táptalaj pH-ja 6,90. 500 ml Corynebacterium simplex ATCC 6946 tenyészettel beoltjuk, és percenként 160 fordulatú turbinával keverve és óránként 18 m3 steril levegővel levegőztetve 30°-on inkubáljuk. 40 órai inkubálás után a tenyészet alkalmas arra, hogy a daunorubicint biokémiailag 20798 RP antibiotikummá alakítsa. A tenyészethez hozzáadunk 100 g daunorubicin-hidrokloridot tartalmazó 4 liter vizes oldatot. Keverés és óránként 15 m3 steril levegő átáramoltatása közben 30°-on 24 óra hosszat inkubálunk. így a daunorubicint 85% kitermeléssel 20798 RP antibiotikummá redukáljuk. b) Extrakció Az előző szakasz szerint kapott 480 liter fermentléhez 55 ml 5n nátriumkarbonát-oldatot adva a pH-t 9-re állítjuk be. A hatóanyagot két centrifugán n-butanol és víz 6:4 térfogatarányú elegyével ellenáramban extraháljuk. A 305 liter térfogatú kivonatot 5—10 Torr nyomáson. 40°-on 20 literre bepároljuk. A bepárolt kivonatot 10 liter 9 pH-ra meglúgosított vízzel mossuk. Mivel a mosóvíz a 20798 RP antibiotikum egy részét magával viszi, ezt a mosóvizet 10—10 liter metil énkloriddal kétszer extraháljuk. A metüénkloridos fázist 10 literre bepároljuk, és hozzáadunk 10 liter n-butanolt. Miután ezt 5 literre bepároltuk, a két butanolos kivonatot egyesítjük, és újra 5 literre bepároljuk. Ezután keverés közben hozzáadunk 50 ml 10 tf% lOn hidrogénkloridot tartalmazó n-butanolt, majd 40°-on, 5-10 Torr nyomáson 3 liter térfogatra bepároljuk. A maradékként kapott oldatot keverés közben lassan hozzáadjuk 30 liter hexánhoz, mire a 20798 RP antibiotikum hidrokloridja alakjában kicsapódik. A csapadékot szűrőn szivatással elválasztva, mosva és szárítva 105 g 20798 RP antibiotikum-hidrokloridot kapunk. c) Tisztítás Az előzők szerint kapott 159 g 20798 RP antibiotikum-hidrokloridot 795 ml metanolban oldunk. A kikristályosodott terméket szívószűrőn elválasztva, mosva és szárítva 111 g kristályos 20798 RP antibiotikum-hidrokloridot kapunkL Tisztasági foka 80%. Az így kapott 111 g terméket 666 ml vízben oldjuk. Az oldatot 0,22 fi pórusátmérőjű sterilizáló membránon át szűrjük. A szüredékhez lassan 6,6 liter acetont adva a 20798 RP antibiotikum-hidroklorid kikristályosodik. A kristályokat szívószűrőn elválasztva 93,1 g tiszta 20798 RP antibiotikum-hidrokloridot kapunk. 3
