168297. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dihidroaunomicin előállítására

3 168297 4 előnyösebb. Erre a célra a fermentációs iparban áltáánosan ismert oltó és fermentáló módszereket és készülékeket használhatunk. A mikroorganizmusok táptalajának szükségszerűen asszimilálható szén- és nitrogénförrást, szervetlen elemeket és növekedési tényezőket kell tartalmaznia. Mindezeket az anyagokat jól meghatározott termékek vagy különféle eredetű biológiai termékekben előforduló komplex keverékek alakjában adhatjuk a táptalajhoz. Asszimilálható szénforrásként szénhidrátokat, például glukózt vagy más hasonló szerves vegyületeket, például cukoralkoholokat vagy bizonyos szerves savakat használhatunk. Ezek helyett vagy mellett előnyösen bizonyos állati vagy növényi olajok, például bálnaolaj vagy szójaolaj is alkalmazhatók. Az asszimilálható nitrogénforrások nagyon sokfélék lehetnek. Használhatunk nagyon egyszerű vegyületeket, például szerves vagy szervetlen ammóniumsókat, karbamidot, bizonyos aminosavakat. A táptalajhoz olyan összetett anyagok alakjában is hozzáadhatjuk a nitrogénforrást, amelyek a nitrogént főleg fehérjeként tartalmazzák, ilyen anyagok a kazein, laktalbumin, glutin és hidrolizátumaik, szójaliszt, földimogyoróliszt, halliszt, pepton, húskivonat, élesztőkivonat, szeszmoslék vagy kukoricalekvár. A hozzáadott szervetlen anyagok közül egyeseknek pufferoló vagy közömbösítő hatásuk lehet, ilyenek az alkáli-vagy alkáliföldfémfoszfátok. Mások a mikroorganizmusok fejlődésére szükséges ionegyensúlyt tartják fenn, mint például az alkálifémek vagy alkáliföldfémek kloridjai és szulfátjai. A fermentáló közeg pH-jának a tenyésztés kezdetén 6,0 és 7,8 között, előnyösen 6,5 és 7,5 között kell lenni. A mikroorganizmusok tenyésztésére a legkedvezőbb hőmérséklet 29-31 C°, de 26 C° és 37 C° között is kielégítő fejlődés érhető el. A táptalaj levegőztetése meglehetősen tág határok között változhat. Azt találtuk azonban, hogy percenként és táptalaj literenként 0,3-3 liter levegő különösen előnyös. Ezenkívül a jó redukálóképességű tenyészet kialakulásának érdekében előnyös a táptalajt keverőszerkezettel keverni. A keveró'szerkezet percenkénti fordulatszáma 100 és 250 között változhat. A mikroorganizmus-tenyészet általában 24—48 óra alatt éri el fejlődésének megfelelő fokát. Az így kapott enzimrendszer redukáló hatása endocelluláris jellegű, ezt az bizonyítja, hogy a szűrt tenyészetnek nincs redukáló hatása. A redukálóképesség ezenkívül lényegében a tenyésztés folyamán keletkezett sejtek mennyiségétől függ. A fermentiéből például centrifugálással elkülönített sejtekkel dolgozva, a daunorubicinből keletkezett 20798 RP antibiotikum mennyisége egyenesen arányos a reakcióközeg sejtkoncentrációjával, a sejtekben dúsabb közeg redukálóképessége nagyobb. A daunorubicinnek 20798 RP antibiotikummá való redukálására a daunorubicinnek vagy egy sójának vizes oldatát hozzáadjuk a kielégítő fejlődési fokot és redukálóképességet elért mikroorganizmus-tenyészethez, vagy ezekből a tenyészetekből izolált s'ejtekhez, vagy az ezekből a sejtekből kapott enzimes kivonathoz. A redukciót általában a táptalaj keverése köz-5 ben, 23 C° és 37 C°, előnyösen 26 C° és 30 C° közötti hőmérsékleten hajtjuk végre, és a redukció 1—4 nap alatt fejeződik be. A redukció 5 és 10 pH között végbemegy, de 10 előnyösen 7 és 8 közötti pH-nál dolgozunk. A tenyészközeget keverhetjük például olyan keverővel, amelynek forgási sebessége percenként 100-250 fordulat. A redukció végrehajtására daunorubicin vagy 15 annak egy tiszta sója vagy egy nyers terméke vagy egy daunorubicintenyészet savas szüredéke használható. Jó kitermelés elérésére a daunorubicin koncentrációja a redukáló közegben előnyösen literenként 0,1-1 g legyen. 20 A redukció után a reakciókeverékből a 20798 RP antibiotikum az elkülönítésére alkalmazni szokott módszerekkel nyerhető ki. A 20798 RP antibiotikum például a ferment-25 léből 9 körüli pH-nál szerves oldószerrel, például kloroformmal, metilénkloriddal, n-butanollal vagy ilyen oldószerek elegyeivel extrahálható. A 20798 RP antibiotikumot a szerves kivonatból mosás és ismételt etrahálás útján úgy 30 nyerhetjük ki, hogy a kivonatokat kis térfogatra pároljuk be, vagy olyan hígítót adunk hozzá, amelyben a 20798 RP antibiotikum oldhatatlan, ilyen hígító például a hexán, majd adott esetben az antibiotikumot savval, például sósavval, sav-35 addíciós sóvá alakítjuk. A 20798 RP antibiotikumot különféle hagyományos tisztítási eljárásokkal, például kristályosítással vagy kromatografálással tisztíthatjuk. 40 A következő példák a találmány gyakorlati végrehajtását szemléltetik, de hatályát semmiképpen sem korlátozzák. A példákban a hőmérsékleti adatokat Celsius-fokban adjuk meg. A meghatározásokat a következő módon végeztük: 45 a) A színes kivonatok hatóanyag-tartalmát spektrofotometrálással, ugyanazzal az oldószerrel készült kalibráló daunorubicin oldatra vonatkoztatva 480 nm-nél határoztuk meg. 50 b)A 20798 RP antibiotikumot kovasavgél-vékonyrétegen való kromatografálással azonosítottuk oly módon, hogy a kapott termék Rf értékét összehasonlítottuk az ugyanazzal az oldószerrel kapott daunorubicin minta, illetve 20798 55 RP antibiotikum minta Rf értékével. c) A 20798 RP antibiotikum termelését a vékonyréteg-kromatogramokból határoztuk meg oly módon, hogy a kivonatnak megfelelő foltok intenzitását összehasonlítottuk a vonatkozási alapként 60 használt 20798 RP antibiotikuméval, vagy a „Chrornosan" lemezek leolvasásakor észlelt csúcsok felületét hasonlítottuk össze, vagy a kromatográfiai vékonyréteglemezről á keresett termék foltjának szintjén eluált 20798 RP antibiotikumot kolori-65 metrálással határoztuk meg. 2