168206. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(5-amino-5-karboxi-valeramido)-3-metil-3-cefém- 4-karbonsav előállítására

11 168206 12 A dezacetoxi-cefalosporin C-t termelő mikroorganizmusok széles hőmérsékletintervallumban, 25 C° és 37 C° közötti hőmérsékleten növekednek. A legtöbb hatóanyag 26 C° és 30 Cc közötti hőmérsékleten szintetizálódik. A táptalaj a legtöbb hatóanyagot általában az inokulálást követő 36,-72 óra közötti időben tartalmazza. Ahogy az a levegőztetett, süllyesztett fermentációk kivitelezésekor szokásos, a táptalajon steril levegőt buborékoltatunk át. A termelő mikroorganizmus jó növekedése és a megfelelő mértékű antibiotikum-termelés érdekében a táptalaj egységnyi térfogatára számítva, percenként 0,2 és 0,4 térfogat levegőt vezetünk át. Az átáramoltatott levegő térfogata előnyösen 0,4 térfogat/táptalaj térfogat/perc. A táptalaj antibiotikum-tartalmát a tenyésztés alatt egyszerű módon határozzuk meg oly módon, hogy mérjük a tenyészlé növekedésgátló hatását olyan mikroorganizmusokkal szemben, amelyek növekedését a dezacetoxi-cefalosporin C gátolja. Erre a célra Sarcina lutea-t vagy Salmonella gallinarumot használunk. A minták mérését a jól ismert turbidimetriás vagy az agardiffúziós módszerrel végezzük. A tenyészlé maximális antibiotikum-tartalmát általában mind a süllyesztett, levegőztetett, mind a rázott tenyészetben végzett fermentáció esetén, az inokulálást követő 1-3. napon mérjük. Mindkét Streptomyces-szel végzett fermentáció esetén az antibiotikum a fermentleben halmozódik fel. Ily módon a találmány szerinti eljárás olyan elkülönítési módszerre vonatkozik, amelynek segítségével az antibiotikumot a lehető legjobb kitermeléssel különíthetjük el a fermentléből. A találmány szerinti eljárás értelmében az antibiotikumok elkülönítésére például úgy járunk el, hogy a micéliumot és a nem oldható szilárd halmazállapotú anyagokat ismert módon, például szűréssel vagy centrifugálással eltávolítjuk a fermentléből, majd a termelt antibiotikum-keveréket extrakcióval egy adszorpciós kromatográfiával különítjük el a szűrt léből vagy a centrifugálás után kapott felülúszóból. A fermentlé szűrletébői a dezacetoxi-cefalosporin C-t mint a fermentáció során szintetizálódott antibiotikum-keverék egyik összetevőjét különítjük el. A többi összetevőtől (például az A 168861, A 16886II és A 16884 jelű, az előzőekben ismertetett antibiotikumoktól) a dezacetoxi-cefalosporán C-t, mint gyakorlatilag tiszta termékeket oszlopkromatográfiás úton különítjük el. Az antibiotikum-keverék adszorpciós eljárással való elkülönítésére előnyösen ioncserélő gyantákat használunk, de adszorbeálható a hatóanyag aktív szénből, szilikagélből, alumíniumoxidból vagy cellulózból készült oszlopon is. A dezacetoii-ceifátesporin C és az előzőekben megadott, a dezacetoxi-eefalosporinnal együtt szintetizálödó antMotikrHnok, a táptalaj végső pH-értekétől függően sóként vagy amföter alakban (ikerionos akk) vannak jelen a tenyészlében. Az antibiotikumok keverékét elkülöníthetjük és elválaszthatjuk egymástól az adszorpciós vagy ioncserés kromatográfia segítségével akkor is, ha az egyik, akkor is, ha a másik alakban, vagy a két alak keverékeként vannak jelen. Ioncserélő gyantaként az antibiotikum elkülö-5 nítésére előnyösen olyan keresztkötésekkel rendelkező polisztirol alapú kvaterner ammómum-típusú gyantákat használunk, amelyek Amberlite és IRA (Rohm and Haas Co., Philadelphia, Pa.), továbbá Dowex (Dow Chemical Co), védjegy-néven árusíta-10 nak, például IRA-68 vagy Dowex 1 gyantákat. A szűrt tenyészlevet - a találmány szerinti eljárás értelmében — egy anioncserélő gyantával, például IRA-68 gyantával töltött oszlopon engedjük át, majd vizes ammóniumacetát, nátrium-15 acetát vagy ammóniumformiát oldattal eluáljuk a megkötött hatóanyagot. Az antibiotikumok a kromatografáló oszlopról az eluáló sóoldat kationjával képzett sóként eluálódnak. Az ioncserés kromatográfiai meg-20 előzően az antibiotikumokat elkülönítjük a szűrt fermentléből és aktív szénnel kivitelezett adszorpciós kromatográfiával részlegesen tisztítjuk őket. A dezacetoxi-cefalosporin C-t tartalmazó antibiotikum-keveréknek az aníoncserélő gyantával való 25 visszanyerését követően a fölös mennyiségű szervetlen anyagokat, például az eluáló sóoldatból származó fölös mennyiségű sót, mint például az ammóniumformiátot, az eluátum aktív szénnel kivitelezett kromatográfiájával különítjük el. 30 Az így elkülönített és tisztított antibiotikum-keverékeket ezután az egyes, a keverékeket alkotó antibiotikumok elválasztására szilikagélből vagy mikrokristályos cellulózból készült oszlopon kromatografáljuk. 35 A találmány szerinti eljárás egyik előnyös kivitelezési változata szerint a dezacetoxi-cefalosporin C előállítására úgy járunk el, hogy a Streptomyces lipmanii NRRL 3584 törzset vizes táptalajon, 6 napon át, körülbelül 30 C° hőmérsékleten tenyészt-40 jük. A micéliumot és a többi nem oldódó anyagot ezután szűrési segédanyag jelenlétében szűréssel eltávolítjuk, a szűrt levet pedig aktív szénnel töltött kromatografáló oszlopon engedjük át. A szennyezőanyagok eltávolítására vízzel mossuk az 45 oszlopot, az antibiotikumot pedig vizes acetonnal eluáljuk. Az eluáláskor több frakciót szedünk, a hatóanyagot tartalmazókat egyesítjük. Az aceton eltávolítására csökkentett nyomáson desztilláljuk az egyesített eluátumokat. A vizes 50 desztillációs maradékot ezután kvaterner ammónium-típusú, bázikus anioncserélő polisztirol gyantával, például formiát- vagy acetát-ciklusú Amberlite IRA-68 gyantával (Rohm and Haas, Philadelphia, Pa.) töltött oszlopon kromatog-55 rafáljuk, vízzel mossuk az oszlopot, majd híg vizes, körülbelül 0,1 mólos ammóniumformiát oldattal eluáljuk az antibiotikumokat. Az eluáláskor több frakciót különítünk el, az aktívakat egyesítés után aktív szénnel kivitelezett kromatográfiával tisz-60 títjuk. Az antibiotikumot tartalmazó eluátumokat töményítjük és fagyasztva szárítjuk. A fagyasztva szárított készítményt vízben oldjuk, az oldatot szilikagélen kromatografáljuk. Az oszlopról vizes acetonitrillel vagy más előnyös oldószerrel eluáljuk 65 a hatóanyagokat. Az eluáláskor több frakciót 6