168206. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(5-amino-5-karboxi-valeramido)-3-metil-3-cefém- 4-karbonsav előállítására

13 lá£206 14 különítünk el. Az első etoátumok az A 16 884 jelű antibiotikumot, a 7-(5-amino-5-karboxi-valeramido)-7-metoxi-3-acetoxi-metlt3-cefihn-4-karbonsavat tar" talmazzák, ammóniumsóként. A további frakciók az A 16 884-et és a penioillin N-t tartalmazzák. Az 5 utolsó frakciókban van oldva a dezacetoxi-cefalosporin C ammóniumsója. A dezacetoxi-cefalosporin C-t szabad savként úgy állítjuk elő, hogy az ammóniumsót tartalmazó vizes oldat pH-ját az izoelektromos pontnak meg- 10 felelő értékre állítjuk be. Eljárhatunk úgy is, hogy a sót tartalmazó vizes oldathoz savas ioncserélő gyantát adunk, amikor, ha olyan gyantát hasz-# nálunk, amely elég savas ahhoz, hogy az oldat pH-ja 2,5-re savanyodjon, megkapjuk a szabad 15 savat. A gyantát szűréssel elkülönítjük a savas oldatból, és a szűrletet fagyasztva szárítjuk. A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös kivitelezési változata szerint a dezacetoxi-cefalosporin C előállítására úgy járunk el, hogy a 20 Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 törzset vizes táptalajon körülbelül 6 napon át tenyésztjük. A micéliumot szűréssel elkülönítjük, a szűrt levet aktív szénből készült, majd ezt követően kvaterner ammónium-típusú polisztirol gyantából, például a 25 Dowex (Dow Chemical Co., Midland, Mich.) vagy Amberlite IRA (Rohm and Haas, Philadelphia, Pa.) védjegyű bázikus anioncserélő gyantából készült oszlopon kromatografáljuk. A gyantát előnyösen formiát- vagy acetát-ciklusban használjuk. 30 Az ioncserélő gyantáról nyert eluátumot a szervetlen anyagok eltávolítására aktív szénből, majd dextránból, végül szilikagélből készült oszlopon kromatografáljuk. A szilikagélről vizes acetonitrillel eluáljuk a 35 hatóanyagot és több frakciót különítünk el. A biológiailag aktív frakciókat egyesítjük és desztilláljuk, vagy előnyösen fagyasztva szárítjuk. Az antibiotikum-keveréket tartalmazó fagyasztva szárított termék minor komponensként tartalmazza a 40 dezacetoxi-cefalosporin C-t. A keveréket a dezacetoxi-cefalosporin C elkülönítésére először mikrokristályos cellulózból (Avicel), majd Amberlite XAD-4 gyantából készült oszlopon kromatografáljuk. A fagyasztva szárított 45 terméket vízben oldjuk, és mikrokristályos cellulózból készült szlopon vezetjük át. Az oszlopot acetonitril:n-propanol:víz = 1 :1 : 0,5 térfogatarányú elegyével eluáljuk, a biológiailag aktív frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson desztillációval 50 töményítjük, majd liofilizáljuk. A liofilizált antibiotikum-keveréket vízben oldjuk, majd az oldatot Amberlite XAD-4 gyantából készült oszlopon kromatografáljuk. A hatóanyagot vízzel eluáljuk az oszlopról, miközben több frakciót különítünk el. 55 Az elkülönített frakciókat papírkromatográfiával vagy mikrobiológiai értékméréssel mérjük, a kizárólag dezacetoxi-cefalosporin C-t tartalmazó frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. A korai eluátum-frakciók az ismert A 168861 60 és a 16886II antibiotikumokat, a 7-(5-amino-5--k a rb o xi-valeramido)-7 -metoxi-3-karbamoiloxi-metil-3-cefém-4-karbonsavat és a 7-(5-amino-5-karboxi-valeramido)-3-karbamoiloxi-metil-3-cefém-4-karbonsavat tartalmazzák, sorrondben. 6S A találmány szerinti eljárást a következőkben példákkal szemléltetjük. 1. példa A dezacetoxi-cefalosporin C előállítása rázott tenyészetben A Streptomyces lipmanii NRRL 3584 mikroorganizmus liofilizátumát az alábbi összetételű agáron tenyésztve spórázó tenyészetet állítunk elő-Dextrin 10,00 g Élesztőkivonat 1,00 g Hidrolizált kazein (N—Z Amin, A-típus, Scheffield Chemical Company) 2,00 g Húskivonat l,00g Agar (háromszor mosott) 20,00 g Desztillált víz 1 liter A táptalaj pH-ját nátriumhidroxiddal 7,0-re állítjuk be. A ferdeagart a Streptomyces lipmanii NRRL 3584 spóráival oltjuk, majd 6 napon át 30 C° hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészetet. Ezután steril desztillált vizet öntünk a tenyészetre, majd a spórák és a sejtek vizes szuszpenziójának előállítására gyengén kapargatjuk a tenyészet felületét. A szuszpenzió 1 ml-ével 100 ml, a következő összetételű vegetatív táptalajt oldunk: Glükóz 15,00 g Szójaliszt 15,00 g Kukoricakivonat (szilárd) 5,00 g Kalciumkarbonát 2,00 g Nátriumklorid 5,00 g Desztillált víz 1 liter A vegetatív táptalaj pH-ját nátriumhidroxiddal 6,7-re állítjuk be. 36 órán át 30 C° hőmérsékleten, 5 cm lökettávolságú, percenként 108-at mozduló reciprok rázóasztalon tenyésztjük a vegetatív tenyészetet. Az így előállított tenyészettel oltjuk a főfermentációs táptalajt. A főfermentációs táptalaj a következő összetételű: Szójaliszt 15,00 g Kazein 1,00 g Nátriumnitrát 3,00 g Glükóz szirup (50%-os) 20,00 g Csapvíz 1 liter A főfermentációs táptalaj 100—100 milliliterét 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokba* öntjük, majd 30 percen át 120 C° hőmérsékleten sterilezzük a táptalajt. Lehűtés után minden táptalajt 5% vegetatív inokulummal oltunk. A fermentációt 72 órán át, 30 C° hőmérsékleten, percenként, körkörös irányban 250-et forduló rázóasztalon 7