168190. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fruktóznak glukozból rögzített enzimmel való előállítására
7 168190 8 tődik egy szervetlen hordozóhoz. Továbbá külön kísérletet végeztünk annak meghatározására, hogy milyen hatással van maga az alumíniumoxid hordozó az izomerizációs reakcióra. Az alábbi példákban a következő fizikai tulajdonságokkal rendelkező hordozót használtuk előnyösen a glükóz-izomerázhoz: A porózus alumíniumoxid jellemzői: Átlagos pórusméret- (Â) 175 Minimális pórusméret (Â) 140 Maximális pórusméret (A) 220 Felület (m2 /g) 100 Pórustérfogat (cm3 /g) 0,6 Porozitás 62,5% Részecskenagyság (mesh) 25-60. A pórusméret eloszlását szokásos módon határoztuk meg és azt találtuk, hogy igen közel van az átlag pórusmérethez (például 175Â-nél 90% ± 26%). 1. példa Az adszorpciós lépéshez 444 IGIU/g egységet tartalmazó glükóz-izomerázt (NOVO Enzyme Corp.) használunk. A glükóz-izomeráz 5 g-ját 28,7 ml 0,1 M 'magnézium-acetát oldathoz adjuk egy 50 ml-es főzőpohárban. A szuszpenziót szobahőmérsékleten 25 percig keverjük, majd szűrőpapíron átszűrjük. A papíron maradó anyagot először 14,3 ml 0,1 M magnéziumacetáttal, majd 14 ml 0,5 M NaHC03-tal és 4,3 ml 0,5 M NaHC03-tal mossuk. Mosás után az anyagokat az eredeti enzimszűrőbe gyűjtjük össze. A szűrlet össztérfogata 50 ml. 500 mg porózus alumíniumoxidot 50 ml-es gömblombikba helyezünk. Ezután 10 ml, fent leírt glükóz-izomeráz oldatot adunk még a lombik tartalmához. A lombikot csatlakoztatjuk egy forgó bepárlóhoz. Vákuumot kapcsolunk a készülékre és a lombikot 30—45 C°-on tartott vízfürdőn forgatjuk, 25 percen keresztül. További 10 ml glükóz-izomeráz oldatot adunk az elegyhez és azonos körülmények mellett még 45 percig folytatjuk a bepárlást. Ez a hozzáadás és bepárlás azonos körülmények mellett 4 óráig tart. Ezt a lépést még kétszer megismételjük újabb 10—10 ml glükóz-izomeráz oldat hozzáadásával. Végül még 7 ml glükóz-izomerázt juttatunk a lombikba, a bepárlást még egy óráig és 10 percig folytatjuk 45 C°-on. A lombikot és tartalmát eltávolítjuk a készülékből és hideg szobában tároljuk, összesen 47 ml glükóz-izomeráz oldatot adunk az alumíniumoxidhoz. 50 ml puffert (0,001 M kobaltkloridot és 0,005 M magnéziumszulfátot tartalmazó 6,8-6,9 pH-értékű 0,01 M nátriummaleátot) adunk az elegyhez és szobahőmérsékleten extraháljuk a mintát a következő órában. Az extraktumot félretesszük (50 ml térfogatban) vizsgálat céljából. Az elegyet ezt követőleg először 200 ml vízzel, majd 10 ml 0,5 M nátriumklorid-oldattal mossuk. Az utolsó mosást zsugorított üvegszűrőn keresztül vízzel végezzük. Ezután az elegyet egy 50 ml-es Erlenmeyer-lombikba helyezzük és 106 napig szobahőmérsékleten tartjuk pufferben, miközben a mintát 5 időnként megvizsgáljuk. Eredmények: Enzimkivonatos elemzési minta (50 ml) - 39,8 IGIU/ml (enzimaktivitás visszanyerés a kivonatban - 90%). 10 Elegy átlagos elemzési minta - 130 IGIU/a minta 500 mg-ja (enzimaktivitás visszanyerés az elegyben - 6%). '•' Átlagos kötődés - 260 IGIU/g. A tárolási stabilitást a 106 napos intervallumban 15 21 periodikusan végzett elemzéssel határoztuk meg, melyek közül az ugyanazon a mintán végzett 16 elemzés 100-150 IGIU per 500 mg vagy 200-300 IGIU per g aktivitást mutatott. 20 2. példa A tartós stabilitás és az enzim felezési idejének meghatározására még egy mintát állítottunk elő átfolyásos reaktorban való felhasználásra, a reak-25 torban iparilag is alkalmazható feltételek mellett folyt keresztül a glükóz-tartalmú oldat. A fent leírt alumíniumoxidot (átlagos pórusméret 175 Â, 25—60 mesh) a következő módon kell előkezelni: 30 11 g porózus alumíniumoxidot egy 100 ml-es üveghengerbe helyezünk, amely dugóval van ellátva. Az alumíniumoxid részecskékhez 100 ml 0,05 M magnéziumacetátot és 0,01 M kobalt-acetátot tartalmazó oldatot adunk (pH = 7,5). A hengert 35 bedugaszoljuk, és a tartalmát a henger felfordításával enyhén összekeverjük, majd 60C°-os vízfürdőbe helyezzük. A reakció kezdete után 15 perccel a hengert megfordítjuk és a folyadékot dekantáljuk. 100 ml fent leírt friss magnézium-kobalt-acetát-40 oldatot helyezünk még a hengerbe, megfordítjuk és 2 és fél órán át szobahőmérsékleten hagyjuk állni. 0,06 M telített ammónium-szulfátoldatban 390 IGIU/ml-t tartalmazó fenti nyers glükóz-izomeráz oldatot az alumíniumoxiddal való reagáltatás 45 előtt a következő módon tisztítunk: Egy főzőpohárban levő 40 ml glükóz-izomeráz oldathoz még 1,4 g ammónium-szulfátot adunk, hogy az enzimet kicsapjuk és a szuszpenziót 20 percig keverjük szobahőmérsékleten. A mintát 50 16 000/perc fordulatszámmal 2 C°-on 30 percig centrifugáljuk. A szupernatánst dekantáljuk és elválasztjuk. A fent leírt magnézium-kobalt-acetát 12 ml-ét a csapadékhoz adjuk és keverjük, majd az enzim oldathoz hozzáadunk 3 ml 0,5 M nátrium-55 hidrogénkarbonátoldatot és összekeverjük a kapott elegyet, hogy az enzim feloldódjék. Az oldatot 15 percre 60 C°-os vízfürdőbe helyezzük. A fürdő eltávolítása után az oldatot 15 percig centrifugáljuk 16 000/perc fordulatszámmal 2 C°-on. A tiszta 60 szupernatáns enzimoldatot dekantáljuk és a csapadékot elválasztjuk. A 28 ml térfogatú enzimoldat pH-értéke 7,5. Ha a tisztítási eljárás során nincs veszteség az aktivitásban, akkor az oldatnak 23,6 IGIU-t kell tartalmaznia, 65 Az elegy előállítása: 4
