168190. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fruktóznak glukozból rögzített enzimmel való előállítására
9 168190 10 A henger megfordítása után a magnézium-kobalt-acetát oldatot dekantáljuk a porózus alumíniumoxidról. A 28 ml enzimoldatot hozzáadjuk a hengerben levő porózus alumíniumoxidhoz. A hengert bedugaszoljuk, megfordítással megkeverjük, 5 majd 60 C°-os vízfürdőre helyezzük. Az enzimet 11 g porózus alumíniumhidroxiddal reagáltatjuk 60 C°-on két és fél óráig. Ez alatt az idő alatt negyedóránként megfordítjuk a hengert. Miután a 60 C°-os vízfürdőt eltávolítottuk, a reakciót még IQ két órán át folytatjuk szobahőmérsékleten, miközben minden 30 percben megfordítjuk a hengert. A reakciót egy éjszakán át megfordítás nélkül szobahőmérsékleten folytatjuk. Az enzimes oldatot dekantáljuk (28,5 ml, pH = 7,1) és vizsgálat céljából 15 félretesszük. Az elegyet 60 ml desztillált vízzel, 40 ml 0,5 M nátriumkloriddal és végül 40 ml magnézium-kobalt-acetát oldattal mossuk. Három mintát veszünk ki (összesen 1 g mennyiségben) a szakaszos reaktorból az elemzéshez. A maradék 2o 10 g-ot átvisszük egy 60 C°-on tartott oszlopos reaktorba. A reaktorba 50% glükózt és 0,005 M magnéziumszulfátot tartalmazó, nátriumszulfit hozzáadásával pufferolt 7,7—8,0 pH-értékű oldatot adagolunk. Az első 26 órában 0,001 M- kobalt- 25 kloridot is táplálunk a reaktorba. 26 óra után azonban már nem adagolunk kobaltkloridot és a fennmaradó időben már csak a magnézium-ionok játszanak aktiváló szerepet. A kezdeti átfolyási sebesség az oszlopban 190 ml/óra. A reakcióidő 30 alatt időnként csökkentjük ezt a sebességet és így a fruktóz konverzióját az elméleti 80-85%-án tudjuk tartani. Az oszlopot 31 napig működtetjük. Ez alatt az idő alatt anyaghiány miatt az oszlop teljesen kiszárad és körülbelül 15 óra hosszat száraz 35 marad. Az enzim felezési idejét megközelítő pontossággal úgy kapjuk meg, hogy kiszámítjuk a gyűjtőedényben összegyűjtött termék mennyiségét és a termék konverzióját. Az enzim számított felezési ideje 42 nap. A használat előtt elvégzett 40 elemzés szerint 381 IGIU/g kötődött meg. Ez azt jelenti, hogy a hordozóra felvitt összes IGIU aktivitás 17,8%-át visszanyertük. A 28,5 ml reagált enzimoldat 161 IGIU/ml-t mutat, ez a reagált enzimoldatban 19,4%-os aktivitás visszanyerést jelent. Az oszlop pH-ját 7,4 és 7,8 között tartjuk a betáplált anyag kis módosításával. A teljes enzimmennyiség az oszlopban 3810 IGIU. 3-10. példa Nyolc oszlopot helyezünk egyszerre üzembe, hogy meghatározzuk a különböző puffer-rendszerek hatását az elegy felezési idejére. Minden esetben a fent leírt porózus alumíniumoxidra (átlagos pórus méret 175 Â, 25-60 mesh) adszorbeáltatjuk a glükóz-izomerázt. A használt enzim két forrásból származik. A 3. és 4. példákban az 1. és 2. példákhoz hasonlóan a glükóz-izomeráz oldat egy Streptomyces törzsből származik (A forrás). Az 5-10. példákban 1000 IGIU/ml-t tartalmazó, másik glükóz-izomerázból készített oldatot (Worthington Biochemical Co.) használunk, (B forrás). Az adszorpció hasonlóan megy végbe, mint a 2. példánál. Minden oszlopba 10 g elegyet helyezünk. A táblázat megjelölt puffer-rendszerekkel ellátott 50%-os glükóz-szubsztrát oldatot mindegyik oszlopon átfolyatjuk a megjelölt kezdeti sebességgel, a sebességet időnként módosítjuk, hogy a 84%-os konverziót fenntartsuk (az elméleti 100%, ha a végtermék 50-50% glükóz-fruktóz tartalmú oldat). A 84%-os konverziót a sebesség csökkentésével érjük el szükség esetén. Valamennyi szubsztrát oldatot és oszlopot állandóan 60 C°-on tartjuk. A pH-t állandó 7,8-értéken tartjuk. Az egyes oszlopokban megkötött enzim mennyiségét IGIU (az elegy súlya g-ban kifejezve) középértékekben adjuk meg 95%-os felső és alsó megbízhatósági határokkal. Az enzim megkötődésének hatásfokát szintén feltüntetjük az egyes példáknál. Ez a hatásfok az egész hordozómennyiségre adszorbeált IGIU-k és az adszorpciós eljárásban használt kezdeti IGIU-k számának százalékos arányát adja meg. Táblázat Példa Enzimforrás Megkötés IGIU/g alsó közép felső Megkötési hatásfok, % Szubsztrát beadagolások (M) Áramlási sebesség ml/óra (kezdő) Felezési (nap) 3. A" 554 573 591 76,5 0,004 MgS04 0,001 CoCl2 0,004 Na2 S0 3 122 49,0 4. A 510 563 616 70,8 0,005 MgCl2 0,001 CoCl2 0,004 NH4HCO3 112 23 5. B 164 206 248 36,5 0,005 MgCl2 0,001 CoCl2 0,004 Na2 S0 3 45 47,0
