168190. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fruktóznak glukozból rögzített enzimmel való előállítására
5 168190 6 nagy felületre van szükség (például több, mint 5 m2 /g), és minthogy az adszorbeált enzimet meg kell védeni a külső hatásoktól, melyek az enzim elszakítására irányulnak, a porózus alumíniumoxid hordozó pórusainak átmérője átlagosan nem lehet nagyobb, mint 1000 Â. A pórusok átlagos átmérője előnyösen 140-220 Â. Az alábbiakban részletesen leírjuk az előnyösen használt hordozó fizikai tulajdonságait. Az alkalmazott porózus alumíniumoxid a kereskedelemben hozzáférhető, a találmány szerint alkalmazott speciális pórusméretű anyag az Engelhard Ind., Inc. gyártmánya, és például a cég 3 251 783 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírása alapján állítható elő. Miután a 100-1000 Â átlagos pórusátmérőjű porózus alumíniumoxid hordozót előállítottuk, előfordulhat, hogy a porózus alumíniumoxidot a kívánt mesh méretre kell aprítani, hogy a rögzített glükóz-izomeráz enzimmel dolgozó reaktort megfelelően tölthessük. Ha olyan oszloppal dolgozunk, a találmány szerinti eljárásban, amelyen folyamatosan áramoltatjuk át a glükóz-tartalmú oldatot, az előnyös hordozó-részecske méret 4—200 mesh között van (Amerikai Egyesült Államok-beli szabvány szita). Körülbelül 4 mesh-nél nagyobb enzim-részecske nagyságnál megnő az idő, amely a megkötés előtt az enzim diffúziójához szükséges, nagyobb a szubsztrát tartózkodási ideje, a szubsztrátnál diffúziós problémák keletkeznek és általában a konverzió nem lesz gazdaságos. Ugyanakkor, ha a hordozóban a részecskék nagysága kisebb, mint 200 mesh, nagyon szoros lesz az oszlopban a töltés, a nyomásesés nem kívánt mértékben megnő és általában egy erősítő berendezésre van szükség. A hordozók különösen előnyös részecskenagysága átlagban 25-80 mesh között van, ebben az intervallumban dolgozunk az alább ismertetett kísérletek során. A porózus alumíniumoxidot megőröljük és átszitáljuk, hogy elérjük a kívánt részecske nagyságot, ezután megfelelő puffer- vagy sórendszerrel hidráljuk, előnyösen pH = 7 értéken. A puffer-rendszert ezután eltávolítjuk a pórusok külső részéről, de a porózus alumíniumoxid részecskéket az adszorpciós lépésig nedvesen tartjuk. Az oldatban levő glükóz-izomerázt a porózus alumíniumoxid hordozó egységnyi súlyára számított olyan koncentrációban juttatjuk a nedves hordozóra, amely a glükóz-izomeráz optimális adszorpciójához szükséges. Az adszorpciót keveréssel, cirkuláltatással, vagy a hordozót tartalmazó fluidizált ágyas reaktor alkalmazásával, vagy más olyan módszer igénybevételével segítjük el, melyek révén fokozódik az enzim tömeges diffúziója a pórusokban. Az optimális adszorpciós idő természetesen több tényezőtől függ, mint például: a hordozó részecske nagysága, az enzim és az átlagos pórusméret egymáshoz viszonyított mérete, a hőmérséklet és a pH, de az adszorpció időtartama .legalább másfél óra. Azt találtuk, hogy a körülbelül 175 Â átlagos pórus méretű porózus alumíniumoxid pórusaiban a glükóz-izomeráz adszorpciójánál az adszorpciós periódus körülbelül 1,5—5 vagy 6 óráig tart és ez elegendő a maximális adszorpció eléréséhez. Az adszorpció 6,9—9,0 pH-értéken jól megy, előnyösen azonban 7,1-8,5 pH-értéken végezzük. 5 Az adszorpció után a lazán kötött enzimet vízzel való mosással eltávolítjuk. A mosás történhet még például körülbelül 0,5 M NaCl sóoldattal, vagy bármilyen olyan, mosásra alkalmas szerrel, amely sem a hordozóra, sem pedig az enzimre nem káros. 10 A gyakorlatban az enzimelegyet oszlopba folyamatos kevert tankreaktorba, fluidizált ágyas reaktorba, vagy bármely olyan edénybe helyezhetjük, amelybe vagy amelyen keresztül vezethetjük az inkubálásra alkalmas enzimelegyet. Az alábbi pél-15 dákban a glükóz-izomeráz-alumíniumoxid elegyet olyan oszlopba töltöttük, amelyeken keresztüláramoltatjuk a glükóz-tartalmú oldatot a megfelelő feltételek mellett. Gazdaságossági okokból előnyösen folyamatos eljárással dolgozunk reaktorban. Az 20 oszlopot köpennyel láthatjuk el, hogy az optimális inkubációs hőmérsékletet és/vagy azt a hőmérsékletet fenn lehessen tartani, amely az enzimelegy felezési idejét növeli. Azt találtuk, hogy 50-70 C° közötti, előnyösen 60 C°-os inkubációs hőmérséklet 25 az, amely nemcsak a glükózból fruktózzá alakítás megfelelő fokát, hanem az enzimelegy hosszú felezési idejét is biztosítja. A szubsztrátoldat előnyösen legalább 45 súly% glükózt tartalmaz. 30 Az inkubáció pH-tartománya és a puffer-rendszer az enzim-rendszertől és a reakciófeltételektől függ. Azt tapasztaltuk, hogy a reakció kedvező lefolyásához előnyös a 7,2-8,2 pH-érték, és különösen előnyös, ha 7,4-7,8 pH-n dolgozunk. A puffer-rend-35 szerek megválasztása általában a szubsztrátoldat savasságától függ, ez a savasság egyrészt magától az oldattól és/vagy a szubsztráthoz adott különböző aktiváló ionok jelenlététől és a pórusok belső környezetéből adódhat. Például, ha egy glükóz-tar-40 talmú oldatot (például 50%-os glükózt) a találmány szerinti glükóz-izomeráz eleggyel inkubálunk, kis mennyiségben kobalt és magnézium ionokat adhatunk a szubsztráthoz, mielőtt az enzimmel érintkezésbe hozzuk. Az ionok savas hatását ellen-45 súlyozhatjuk szulfit-sók hozzáadásával, ezzel egyidejűleg az elegy stabilitását is megnöveljük. A különböző puffer-rendszerek, melyeket a glükóz-izomeráznál használunk, önmagukban ismertek, és a szakember által könnyen meghatározhatók. 50 Az alábbi példákban két különböző glükóz-izomeráz készítményt használtunk az elegy előállításához és a stabilitás, valamint a felezési idő szempontjából az eredmények összehasonlíthatók 55 voltak. Az elegyet standard körülmények között vizsgáltuk szakaszos reaktorban. Az eredményeket Nemzetközi Glükóz Izomeráz Egységekben (IGIU) fejezzük ki, ahol 1 IGIU az az enzimmennyiség, amely 1 ju mól glükóz fruktózzá alakításához szük-60 séges 1 perc alatt 60C°-on és 6,85 pH-értéken. A hordozót és az elegyeket az alábbi módon állítottuk elő és meghatároztuk az elegyek tartós stabilitását és felezési idejét. Kísérleteket végeztünk, hogy összevethessük az elegyek hatékonyságát olyan elegye-65 kével, melyekben a glükóz-izomeráz kémiailag kö-3
