168127. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tiszta szérumalbumin biológiai folyadékokból történő izolálására

168127 3 4 szteroidhormonokkal, hemopigmentekkel és további adalékokkal erősen szennyezettek. Az egyik eljárás szerint fenti típusú nyersanyag feldolgozásánál a hemopigementeket cinksok beadagolásával távolítják el az albuminoldatból. Az eljárást részletesen Surgenor D. a Quart Rev. Met. (19S2) 9. és 148. oldalán tárgyalja. Az eljárást nem alkalmazzák széles körben, mivel a mérgező hatású cinkionok az oldatból nehezen távolíthatók el, a folyamat többlépcsős és bonyolult továbbá az albumin hozama alacsony. Egy további eljárással Od. 275 038 számú osztrák szabadalmi leírás) megoldották az albumin izolálását plazmából és szérumból és a hemopigmentek leválasztását az albuminból. A hemopigmentek etilalkohollal, 0 C°-nál alacsonyabb hőmérsékleten, citromsav, kénsav és sósav sóinak jelenlétében eltávolítják. Az eljárással kielégítő eredményeket csak akkor érnek el, ha a-kündulási anyag kevés hemopigmentet tartalmaz. Az eljárás hátránya, hogy az albumin oldatból a sókat dialízissel kell eltávolítani. Az albuminnak a nem fehérje eredetű kisérő adalékoktól, így hemopigmentektől, epefestékektől, szteroidhomonoktól való elválasztása igen bonyolult, mely azzal magyarázható, hogy ezek az anyagok az albuminnal komplex vegyületet képeznek. A komplex vegyületek jelenléte következtében a hagyományos tisztítási eljárások, amelyeket a fehérjekeverékek frakcionálásánál alkalmaznak kevésbé hatékonyak. A találmány célja a felsorolt hátrányok kiküszöbölése. A találmány feladatául tűztük ki olyan technológiai paraméterek kidolgozását, melyek lehetővé teszik a kísérő fehérjék leválasztását, és egyidejűleg a szérumalbumin és a nem fehérje szerkezetű kísérőanyagok komplexének megbontását, amelyek a klinikai alkalmazást akadályozzák. A feladat megoldásaként olyan eljárást dolgoztunk ki tiszta szérumalbumin biológiai folyadékokból történő izolálására, amely szerint valamely albumintartalmú biológiai folyadékot egy rövidszénláncú alifás alkohollal és valamely 6—12 szénatomos gyógyászatilag elfogadható alifás karbonsavsóval kezeljük. A találmány azzal jellemezhető, hogy valamely albumintartalmú biológiai folyadékot az elegy súlyára számított 0,1—0,6%-os mennyiségben 6—12 szénatomos gyógyászatilag elfogadható telített alifás karbonsavsó, előnyösen nátrium- vagy káliumsó jelenlétében - 2-5 pH-értéken az elegy térfogatára számított 15—35%-os mennyiségben rövidszénláncú alkohollal kezeljük, amikor a kísérő fehérjék részben vagy egészen denaturálódnak, majd a denaturált és natív kísérő fehérjéket 4-5 pH-értéken 1-30 °C közötti hőmérsékleten kicsapjuk, amikor is a csapadék a denaturálási művelet során lehasadó és a szérumalbuminnal komplexet képező nem fehérje szerkezetű vegyületeket abszorbeálja, majd a kapott tiszta szériumalbumint tartalmazó oldatot 1-30 °C közötti hőmérsékleten 4-5 pH-értéken a csapadéktól ismert módon elválasztjuk. Alkanolként célszerűen 25 térf.%-os mennyiségben etilalkoholt, a zsírsavsók közül előnyösen 0,3 súly% nátrium-kaprilátot alkalmazunk. Alkalmazhatunk továbbá nátrium-kaprinátot vagy nátrium-kapronátot is. A reakció alatt előnyösen 3,3—4,6 pH-értéket állítunk be és 15-22 °C hőmérsékletet biztosítunk. 15 térf.%-nál kisebb mennyiségű rövidszénláncú 5 alkanol alkalmazásával csökken a leválasztott albumin tisztasági foka, 35 térf.%-ánál magasabb alkanolkoncentráció esetén az albuminmolekula konformációja irreverzibilis változásokat szenved. A találmány szerint az elegyhez 0,1—0,6 súly% 10 zsírsavsót adunk. Ha a megadott határértéknél kisebb mennyiségben alkalmazzuk a sóoldatot, a leválasztott szérumalbumin tisztasági foka nem lesz kielégítő. A határértéknél nagyobb sókoncentráció nem 15 kívánatos mennyiségű albuminveszteséghez vezet. Ha a reakció 2 pH-nál kisebb értéken játszódik le, úgy a szérumalbumin denaturálási veszélye megnő, tisztasági foka azonban nem növekszik. Ha a közeg pH-ja 5-nél nagyobb, a szérumalbumin tisztasági foka 20 nem kielégítő. A folyamat alatt a hőmérséklet nem emelkedhet 30 °C fölé, mivel a hőmérséklet emelkedése a szérumalbuminban irreverzibilis denaturálási változásokat vonhat magával. 25 Kiindulási anyagként donor-vérplazmát, placentavagy abortusz során keletkező vérszérumot, placentaextraktumot, emlősállatok vérplazmáját, amelyből előzőleg a szokásos módszerekkel más frakciókat, így a fibrinogént és a gammaglobulint leválasztottuk, al-30 kalmazunk. A fehérjetartalmú oldathoz az elegy térfogatára számított 15-35%-os mennyiségben rövidszénláncú alifás alkoholt, előnyösen etilalkoholt adunk. Ezután az elegyhez 0,1-0,6% alifás gyógyászatilag elfogad-35 ható karbonsavsót adunk. Az oldat hőmérsékletét 1-30 °C-ra, pH-ját 2-5 között állítjuk be. Ezalatt a szérumalbumint kísérő fehérjék a beállított pH-értéktől függően részben vagy teljesen denaturálódnak. Ezután 4-5 pH-értéket állítunk be, mi-40 mellett 1—30 °C hőmérséklet-tartományt biztosítunk. A denaturált és natív fehérjék fenti körülmények között a nem fehérje szerkezetű kísérő anyagokkal együtt kicsapódnak. A kapott oldat tiszta szérumalbumint tartalmaz, 45 amelyet a csapadéktól 4-5 pH-án és 1-30 °C hőmérséklet-tartományban leválasztunk. A javasolt eljárással lehetővé válik gyógyászati és laboratóriumi célokra alkalmas szérumalbumin izolálása. Az így előállított szérumalbumin tisztasági foka 50 megközelítően 100%-os (elektroforézises módszer). A szérumalbumin hemopigment- és káros kísérőanyagtartalma olyan határokon belül mozog, amely a klinikai alkalmazást nem gátolja. A reakciókeverék hőmérsékletének megközelítően 55 0 °C-ra való csökkenésével a szérumalbumin kicsapódása megnövekszik ezért nem célszerű 1 °C-nál alacsonyabb hőmérsékleten dolgozni. Az eljárás az alkohol és a zsírsavanion közös hatásán alapul savas közegben és 0 °C-nál magasabb 60 hőmérsékleten. E tényezők közös hatása elengedhetetlen követelmény a kívánt tisztaságú albumin izolálásához. Az albumin a nem fehérje szerkezetű kísérőanyagokkal un. komplexeket képez. E komplexek a savas 65 reakcióközegben az alkohol hatására disszodálnak. A 2