168033. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pankreatin előállítására

3 4 tontartalma miatt centrifugálása nagyüzemi méretben nehézségeket okoz. Az 1 295 302 számú francia szabadalom szerinti eljárásban a szervet mechanikusan megtisztítják a zsíros részektől, megorlik és éterrel kezelik zsírtalanítás és az enzimek felszabadítása céljából. Ezután az elegyet centrifugálják és az egyes fázisokat szétválasztják. A vizes oldatban levő enzimeket ammóniumszulfátos frakcionált kicsapással elkülönítjük. Az eljárás hátránya, hogy a szerv mechanikus megtisztítása a zsíros részektől ipari méretben nehezen vihető keresztül. Ugyancsak nehezen oldható meg nagyüzemi méretben az éteres kezelés, majd az étert tartalmazó elegy centrifugálása és a keletkezett három fázis elkülönítése. Az ezt követő ammóniumszulfátos frakcionált kicsapással nyert termék magas sótartalmú. A 166 460 számú szovjet szabadalom szerinti eljárásban a marhapankreászt etanollal kezelik 24 órán át, az etanol elkülönítése után a szervet liofilezéssel szárítják, a száraz terméket fiziológiás konyhasó-oldattal kivonatolják, majd az enzimeket kicsapják. Az eljárás hátránya, hogy kiindulási anyagként csak marhapankreászt alkalmaz, amely ugyan minimális zsírtartalmú, de lipáz-aktivitást is csak nyomokban tartalmaz. A szerv liofilezése szintén nehéz. A 3 260 654 számú amerikai szabadalom szerinti eljárásban az őrölt pankreászt kalcium-ionok jelenlétében autolizálják, majd az így feltárt szerv elkülönítése után az enzimeket etanollal kicsapják és szárítják. Az eljárás hátránya, hogy a kalcium-ionok aktiválják a tripszint, amely az autolízis során bontja a többi enzim-fehérjét, és ezért az így kapott termék magas fehérjebontó aktivitással rendelkezik ugyan, de amiláz- és lipáz-aktivitása csekély. A találmány célja olyan, nagyüzemi méretben könnyen megvalósítható eljárás biztosítása, amely kiküszöböli az ismert eljárások hátrányait és lehetővé teszi olyan pankreatin előállítását, amely megfelelő mennyiségben és arányban tartalmaz fehérje-, szénhidrát- és zsírbontó-enzimeket, és oldékonysága megfelel a felhasználási követelményeknek. Kísérleteink során azt a meglepő felismerést tettük, hogy ha 3-8 közötti pH tartományban úgy végezzük a pankreász vizes kivonását és/vagy az enzimeknek a kivonatból való kicsapását, hogy a homogén folyadék-fázisú kivonatoló, illetve kicsapó elegy halogénezett szénhidrogéneket és 1—4 szénatomos alkoholt és/vagy ketont tartalmaz, akkor az enzimek igen jó hatásfokkal kivonatolhatok, és a kivonatból jól ülepíthető és kezelhető csapadékot kapunk, amelyből jó termeléssel és magas fajlagos aktivitással rendelkező olyan pankreatin nyerhető, amely tripszint, amilázt és lipázt a természetesnek megfelelő arányban tartalmaz. Felismerésünk azért meglepő, mert ismert tény, hogy a halogénezett szénhidrogének enzim-denaturáló hatásúak, és elsősorban a lipázt irreverzibilisen károsítják. A találmány eljárás pankreatin előállítására állati pankreászból vizes, vagy szerves oldószer tartalmú vizes kivonás, majd a kivonatból a pankreatin kicsapása útján. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy szerves oldószer tartalmú vizes kivonószerként víz és legfeljebb 50 térf.% halogénezett szénhidrogén és 1—4 szénatomos alkohol és/vagy keton homogén elegyét használjuk, és a kicsapást vizes extrahálás esetén legalább a kivonatével azonos térfogatú halogénezett szénhidrogén és 1—4 szénatomos alkohol és/vagy keton elegyével, vizet tartalmazó szerves 5 oldószeres extrahálás esetén pedig adott esetben halogénezett szénhidrogént tartalmazó 1-4 szénatomos alkohollal és/vagy ketonnal végezzük, ahol a szerves oldószer mennyisége legalább 50 térf.%. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganat osí-10 tási módja szerint a kivonáshoz széntetraklorid vagy triklóretilén, továbbá etanol vagy aceton elegyét legfeljebb 50 térf.% mennyiségben tartalmazó vizes oldószert használunk. Vizes extrahálás esetén a kicsapást célszerű széntetraklorid vagy triklóretilén és 15 etanol vagy aceton elegyével végezni. Vizet tartalmazó szerves oldószeres extrahálás esetén a kicsapást előnyös széntetraklorid vagy triklóretilén és etanol vagy aceton elegyével végezni. 20 A kivonó, illetve a kicsapó oldószerben használt halogénezett szénhidrogén mennyiségét célszerű úgy megválasztani, hogy a kicsapó oldószer hozzáadása után a folyadékfázis homogén legyen. Ellenkező esetben ugyanis csökkenhet a lipáz aktivitása a kapott 25 pankreatinban. Ilyen szempontból előnyösnek találtuk a kivonást, illetve a kicsapást olyan oldószerrel végezni, amely aceton felhasználása esetén 3 térf.%-nál, etanol felhasználása esetén 20 térf.%-nál nem nagyobb mennyiségű halogénezett szénhidrogént 30 tartalmaz. A találmány szerinti eljárás előnyei közül a következőket említjük meg: a) A találmány szerinti oldószerek használata esetén a zsíros szerv feltáródik és az enzimek kivonha-35 tósága javul. b) Az oldószer-elegy magas zsíroldó hatása következtében a szervben levő zsírok oldásához szükséges oldószer-koncentráció esetében még nem áll fenn az enzim-fehérjék kicsapódásának a veszélye, ami veszte-40 séget okozhat; ennél az oldószer-koncentrációnál azonban már a szerv könnyen elkülöníthető a kivonattól. c) A lipáz kivonhatósága olyan mértékben megnövekszik, hogy az ismert oldószerekkel ellentétben a 45 kapott végtermékben az enzimek egymáshoz viszonyított aránya közel áll a természeteshez. d) Amennyiben a kivonáshoz is szerves oldószer tartalmú elegyet alkalmazunk, a szerv elkülöníthetősége jelentősen javul. 50 e) A találmány szerinti oldószerek használata esetén a kapott csapadék igen gyorsan ülepszik, jól kezelhető. f) A zsírtalanításhoz és víztelenítéshez jelentősen kisebb mennyiségű oldószer szükséges, mint az eddigi 55 eljárások esetében. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. A pankreatin tripszin- és amiláz-aktivitásának a meghatározását a VI. Magyar Gyógyszerkönyv előírá-60 sa, lipáz-aktivitásának a meghatározását pedig a British Pharmakopea (1968) előírása szerint végeztük. A példákban megadott értékek azt jelentik, hogy a fenti gyógyszerkönyvek által megadott minimális értéknek hányszorosa az adott 65 enzim aktivitása. 2