167856. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminopenicillinek előállítására
15 167856 16 pufferoldatban szuszpendáljuk, amelyhez 2 súlyrész D-fenilglicin-metilésztert és 1 súlyrész 6-amino-penicillánsavat adunk. Az elegyet keverés közben 2 órán át 37 C°-on inkubáljuk, az elegy pH-ját 1 n nátriumhidroxid-oldattal6,0-ra állítjuk. 11,5 mg/ml oc-amino-benzil-penicillin képződik. A sejteket centrifugálással eltávolítjuk a reakcióelegyből, és a felső folyadékréteget 160 térfogatrész kereskedelemben kapható polisztirol-típusú adszorbenssel (Amberlite XAD—2, a Rohm & Haas cég (USA) termékel töltött oszlopon bocsátjuk át. Az oszlopot 400 térfogatrész desztillált vízzel, majd 500 térfogatrész 4: 1 arányú víz-metanol eleggyel mossuk, majd 1: 1 arányú víz-metanol eleggyel leoldjuk a kívánt terméket. Az eluátumot csökkentett nyomáson bepároljuk. 0,83 súlyrész kristályos a-amino-benzil-penicillint kapunk; o. p.: 200—202 C° (bomlás). A termék infravörös spektruma azonos a hiteles a-amino-benzil-penicillin-monohidrát mintáéval. 9. példa Acetobacter sp. IFO 13209 törzset 24 órán át tenyésztünk, és 30 térfogatrész így kapott tenyészettel 2000 térfogatrész, 1% glükózt, 1% húskivonatot, 1% peptont és 0,5% nátriumkloridot tartalmazó, pH = 7,0 értékű táptalajt oltunk be. Az elegyet levegőztetés és keverés közben 24 órán át 28 C°-on tenyésztjük. A sejteket centrifugálással elkülönítjük a fermentlétől, 200 térfogatrész 0,05 mólos foszfátpufferoldatban (pH = 6,0) szuszpendáljuk, majd 20 percig lOkilociklus/másodperc teljesítménnyel besugározzuk. A besugárzott mintákat dezoxiribonukleázzal kezeljük, a fehérjéket kalciumfoszfát-géllel eltávolítjuk, majd az elegyet 60%-os telített ammóniumszulfát oldattal kezeljük. A kivált csapadékot 0,01 mólos foszfátpufferoldatban (pH = 6,8) oldjuk, az oldatot éjszakán át dializáljuk, majd a szenynyező fehérjéket dietilaminocellulózzal eltávolítjuk. A kapott oldatot liofilizáljuk. 0,3 súlyrész nyers, porszerű enzimet kapunk. 0,08 súlyrész nyers, porszerű enzimet 100 térfogatrész 0,01 mólos foszfátpufferoldatban oldunk, az oldathoz 1,1 súlyrész kálium-6-aminopenicillanátot és 3 súlyrész D-fenilglicin-metilésztert adunk, és az elegyet 1 órán át 37 C°-on inkubáljuk. Ezalatt az elegy pH-értékét 0,1 n nátriumhidroxid-oldat adagolásával 6,0-n tartjuk. A reakcióelegyet a 8. példában leírt módon dolgozzuk fel. 0,42 súlyrész kristályos a-amino-benzil-penicillint kapunk. 10. példa 50 térfogatrész, a 8. példában ismertetett összetételű „F" táptalajt Xanthomonas pruni IFO 3780 törzzsel oltunk be, és az elegyet rázás közben 24 órán át 28 C°-on tenyésztjük. A kapott fermentlével 500 térfogatrész „F" táptalajt oltunk be, és az elegyet rázás közben 24 órán át 28 C°-on tenyésztjük. A fermentléből centrifugálással elkülönítjük a sejteket. A sejteket 100 térfogatrész 0,05 mólos foszfátpufferoldattal (pH = 6,0) mossuk, majd a sejteket 200 térfogatrész fenti pufferoldatban szuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz 2 súlyrész D-1-ciklohexenil-glicin-metilésztert és 1 súlyrész 6-amino-penicillánsavat 5 adunk, és az elegyet keverés közben 1 órán át 37 C°-on inkubáljuk. Eközben az elegy pH-ját 1 n nátriumhidroxid-oldat adagolásával 6,0 értéken tartjuk. A reakcióelegyet a 8. példában leírt módon dolgozzuk fel. 0,42 súlyrész 6(a-amino-l'-ciklohexenil-acet-10 amido)-penicillánsavat kapunk. A fehér, kristályos termék 182—184 C°-on olvad bomlás közben, /otfé = 225° (c = 0,5,0,1 n sósavoldatban). NMR spektrum (D 20-ban): 8 = 1,79 s (2-CH 3), 1,92s (2-CH3 ), 4,50s (3-H), 4,82s (az oldallánc a-szénatomjá-15 hoz kapcsolódó hidrogén), 5,80B (6H+7H) és 6,22 ppm (a ciklohexén-gyűrű olefines hidrogénatomja). Az 5. táblázatban a fenti módon kapott termék különböző mikroorganizmusokkal szemben kifejtett antibakteriális hatásának adatait ismertetjük. 6. táblázat Vizsgált mikroorganizmus Minimális gátló koncentráció, tig/ml Staphylococcus aureus 209P 0,05 Staphylococcus aureus No. 87 50 Bacillus subtilis PCI 219 0,02 Sarcina lutea PCI 1001 <0,01 Escherichia coli NIHJ 0,5 Klebsiella pneumoniae Kbl >100 Proteus vulgaris Eb51 10 Proteus morganii Eb53 >100 Proteus morganii Eb54 5 Proteus mirabilis Eb59 5 Pseudomonas aeruginosa Pdl 100 Pseudomonas aeruginosa 10490 100 50 11. példa A 6. táblázatban felsorolt mikroorganizmusokkal 50 55 térfogatrész „F" vagy „G" táptalajt oltunk be, és az elegyet rázás közben 18 órán át 28 C°-on tenyésztjük. Az egyes tenyészetekből centrifugálással elkülönítjük a sejteket 5 térfogatrész 0,2 mólos foszfátpufferoldatban (pH = 6,0) szuszpendáljuk. A kapott szuszpenziókhoz 60 0,1 súlyrész 6-amino-penicillánsavat és 5 térfogatrész 0,1 mólos K2 HP0 4 -oldatot adunk, amely 0,3 súlyrész, a 6. táblázatban megadott D-fenilglicin-származékot tartalmaz. Az elegyeket rázás közben 30 percig 37 C°-on inkubáljuk. A képződött a-amino-benzil-penicillin 65 mennyiségét (mg/ml) a 6. táblázatban közöljük. 8
