167856. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminopenicillinek előállítására
13 167856 14 sav (pH = 6). A kapott elegyet rázás közben 4 napon át 28 C°-pn tenyésztjük. A kapott tenyészethez 10 súlyrész kálium-penicillin-V 100 térfogatrész 0,25 mólos foszfátpuffer-pldattal (pH = 7) készített oldatát adjuk, és az elegyet rázás közben 16 órán át 28 C°-on inkubáljuk. A mikroorganizmus-sejteket kiszűrjük. A kapott oldat ninhidrines mérés alapján 5,3 mg/ml 6-amino-penicillánsavat és kb. ekvimoláris mennyiségű fenoxiecetsavat tartalmaz. 5000 térfogatrész „E" táptalajt Acetobacter sp. IFO 13209 törzzsel oltunk be, és az elegyet 20 órán át 37 C°on inkubáljuk. A sejteket centrifugálással elkülönítjük és 1000 térfogatrész 0,9%-os nátriumklorid-oldattal mossuk. A 6-amino-penicillánsavat tartalmazó fenti oldathoz 75 súlyrész, a korábbiakban leírt módon előállított, nedves Acetobacter sp. IFO 13209-sejtet és 20 súlyrész D-fenilglicin-metilésztert adunk, és az elegyet rázás közben 1 órán át 37 C°-pn inkudáljuk. A kapott elegy 4,8 mg/ml a-amino-benzil-penicillint tartalmaz. 4. táblázat Aminopeniciliin, mg/ml Mikroorganizmus I. II. Mycoplana dimorpha IFO 13213 Acetobacter xylinum IFO 3144 Acetobacter pasteurianum IFO 3223 0,3 0,3 0,4 0,4 0,2 0,1 10 I. = 6-(a-amino-a-)4-hidroxi-fenil/-acetamido/-penicillánsav II. = 6-(a-amino-«-)3,5-diklór-4-hidroxi-fenil/-acetamido/-penicillánsav 15 Megjegyezzük, hogy a 6-[a-amino-a-(4-hidroxi-fenil)-acetamidoj-penicillánsav 6-amino-penicillánsavból és DL-4-hidroxi-fenilglicin-metilészterből, míg a 6-[a-amino-a-(3,5-diklór-4-hidroxi-fenil)-acetamido]-penicillánsav 6-amino-penicillánsavból és dl-3,5-diklór-4-20 -hidroxi-fenilglicin-metilészterből képződik. 8. példa 5 térfogatrész, 2,0% szacharózt, 0,2% mononátriumglutamátot, 0,2% élesztőkivonatot, 0,5% peptont, 0,2% dikálium-hidrogénfoszfátot, 0,1% magnéziumkloridot és 0,01% vas(II)-szulfátot tartalmazó, pH =7,2 értékű táptalajt („F" táptalaj) Xanthomonas oryzae IFO 3995 törzzsel oltunk be, és az elegyet rázás közben 1 napon át 28 C°-on tenyésztjük. A kapott tenyészettel 100 térfogatrész „F" táptalajt oltunk be, és az elegyet rázás közben 1 napon át 28 C°-on tenyésztjük. A sejteket centrifugálással elkülönítjük a fermentlétől, és 100 térfogatrész pH = 6,0 értékű 0,05 mólos foszfátpufferoldattal mossuk. A sejteket 100 térfogatrész fenti 5. példa Protaminobacter alboflavus IFO 13221 törzset 2 napig tenyésztünk, és 0,5 térfogatrész így kapott tenyészettel 30 térfogatrész pH =7,2 értékű, 1,0% húskivonatot, 1,0% peptont és 0,5% nátriumkloridot tartalmazó táptalajt oltunk be. Az elegyet rázás közben 48 órán át 28 C°-on tenyésztjük. A kapott táptalajhoz 15 térfogatrész 0,25 mólos citrátfoszfát-pufferoldatban (pH = 4,5) oldott D-fenilglicin-metilésztert, DL-4-hidroxi-fenilglicin-metilésztert, illetve DL-4-hidroxi-3,5-diklór-fenilglicin-metilésztert adunk, majd az elegyhez 6-amino-penicillánsavat adunk. A reagensek végső koncentrációja 1 mg/ml. Az így kapott elegyeket rázás közben 1 órán át 37 C°-on inkubáljuk. A 6-amino-penicillánsavból és D-fenilglicin-metilészterből 0,7 mg/ml a-amino-benzil-penicillin; a 6-amino-penicillánsavból és DL-4-hidroxi-fenilglicin-metilészterből 0,3 mg/ml 6-(a-amino-a-/4-hidroxi-fenil/-acetamido)-penicillánsav; illetve a 6-amino-penicillánsavból és DL-4-hidroxi-3,5-diklór-fenilglicin-metilészterből 0,4 mg/ml 6-[a-amino-a-(3,5-diklór-4-hidroxi-fenil)-acetamidoj-penicillánsav képződik. 6. példa 7. példa 25 30 térfogatrész táptalajt (összetétel: 1,0% húskivonat, 1,0% pepton és 0,5% nátriumklorid; pH =7,2) 0,5 térfogatrész kétnapos Xanthomonas sp. IFO—13215, illetve Xanthomonas citri IFO—3781 tenyészettel ol-30 tunk be, és az elegyet 48 órán át 28 C°-on rázatjuk. 30—30 térfogatrész így kapott tenyészethez 15 térfogatrész 0,25 mólos citrát-foszfát-pufferoldatban (pH = 4,5) oldott D-fenilglicin-metilésztert vagy DL-4-hidroxi-fenilglicin-metilésztert és 6-amino-penicillánsavat 35 adunk, és a reagensek végső koncentrációját 1 mg/ml értékre állítjuk be. Az elegyeket rázás közben 1 órán át 37 C°-on inkubáljuk. Xanthomonas sp. IFO 13215 mikroorganizmus alkalmazása esetén D-fenilglicin-metilészterből és 6-amino-40 -penicillánsavból 0,5 mg/ml a-amino-benzil-penicillin, míg DL-4-hidroxi-fenilglicin-metilészterből és 6-amino-penicillánsavból 0,2 mg/ml 6-[a-amino-«-(4-hidroxi-fenil)-acetamido]-penicillánsav képződik. Xanthomonas citri IFO 3781 tenyészet esetén a meg*' felelő kiindulási anyagokból 0,4 mg/ml a-amino-benzil-penicillin, illetve 0,6 mg/ml 6-(a-amino-a-/4-hidroxi-fenil/-acetamido)-penicillánsav képződik. Mycoplana dimorpha IFO 13213-t, Acetobacter xyli- 50 num IFO 3144-t és Acetobacter pasteurianum IFO 3323-t 2 napig tenyésztünk, és 1—1 térfogatrész tenyészettel 30—30 térfogatrész, 1% húskivonatot, 1% peptont és 0,5% nátriumkloridot tartalmazó, pH = 7,2 értékű táptalajt oltunk be. Az elegyeket rázás közben 55 48 órán át 28 C°-on tenyésztjük. Az így kapott tenyészetekhez 15 térfogatrész 0,25 mólos citrát-foszfát-pufferoldatban oldott DL-4-hidroxi-fenilglicin-metilésztert vagy DL-4-hidroxi-3,5-diklór-fenilglicin-metilésztert és 6-amino-penicillánsavat 60 adunk. Az oldószerként felhasznált pufferoldat pH-értéke 4,5, A reagensek koncentrációját 1 mg/ml értékre állítjuk be. A kapott elegyeket 1 órán át 37 C°-on inkubáljuk. A képződött fermentlevek aminopenicillintartalmát a 4. táblázatban közöljük. 65 5 Mycoplana dimorpha IFO 13213 Acetobacter xylinum IFO 3144 Acetobacter pasteurianum IFO 3223 15 20 7
