167856. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminopenicillinek előállítására
11 167856 12 bepároljuk, és a kapott maradékot 20 térfogatrész 1: 1 arányú metanol-dietiléter elegyből kristályosítjuk. Kb. 10 súlyrész DL-1-ciklohexenil-glicin-metilésztert kapunk. NMR spektrum (D 20-ban): 8 = 1,7 B (4 proton a gyűrű C—4 és C—5 szénatomján), 2,05B (4 proton a gyűrű C—2 és C—6 szénatomján), 3,92 s (3 proton a metanil-csoportban), 4,64s 1 proton a gyűrű olefines szénatomján). (S = szingulett, B = széles). (C) D-1-ciklohexenil-glicin-metilészter előállítása 10 súlyrész DL-1-ciklohexenil-glicin-metilészter-hidroklorid 1000 térfogatrész vízzel készített oldatát 2 n nátriumhidroxid-oldattal pH = 7,2-re lúgosítjuk, és az oldathoz 1 súlyrész kereskedelemben kapható kimotripszint adunk („a-Chymotrypsin", a Sigma Chemical-Company, Missouri, USA cég terméke, kimotripszin aktivitás: 50 egység/mg). Az elegyet 2 órán át 23 C°-on inkubáljuk, és pH-értékét 1 n nátriumhidroxid-oldattal 7,2-re állítjuk. A reakcióelegyet 5 n nátriumhidroxid-oldattal pH = 8,0-ra lúgosítjuk, majd 5 X 1300 térfogatrész dietiléterrel extraháljuk. A dietiléteres oldatot 25 C°-on, csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A barna, olajos maradékhoz 100 térfogatrész sósavval telített metanolt adunk, és az elegyet csökkentett nyomáson bepároljuk. A kapott maradékhoz 30 térfogatrész dietilétert csepegtetünk, és az elegyet bepároljuk. 3,5 súlyrész D-1-ciklohexenil-glicin-metilésztert kapunk, amelynek NMR spektruma megegyezik a DL-1-ciklohexenil-glicin-metilészterével. (a)£ = - 115° (c =0,5, 0,1 n sósavoldatban). /. példa A DL-1-ciklohexenil-glicin-metilészter és 6-amino-penicillánsav, DL-ciklohexil-glicin-metilészter és 6--amino-penicillánsav, illetve a D-fenilglicin-metilészter és 6-amino-penicillánsav kondenzációs reakcióját az 1. kísérletben ismertetett mikroorganizmusok jelenlétében hajtjuk végre. A reakciót az 1. kísérletben ismertetett módon végezzük azzal a különbséggel, hogy a mikroorganizmus tenyésztésére „C" vagy „D" táptalaj helyett az „E" táptalajt használjuk fel. Az aminopenicillinek mennyiségét a 2. táblázatban adjuk meg. 2. táblázat Termelt anyag, mg/ml Mikroorganizmus I. ii. III. Mycoplana dimorpha IFO 13213 4,4 2,8 0,6 Acetobacter sp. IFO 13211 3,5 0,5 0,4 Acetobacter sp. IFO 13209 4,5 3,4 3,2 Acetobacter sp. IFO 13210 4,7 0,5 1,8 Aeromonas sp. IFO 13212 4,2 0,8 0,5 Xanthomonas sp. IFO 13215 3,5 1,5 1,8 I. = «-amino-benzil-penicillin II. = 6-(«-amino-l'-ciklohexenil-acetamido)-penicillánsav III. = 6-(a-amino-ciklohexil-acetamido)-penicillánsav 2. példa Gluconobacter cerinus IFO 3263, Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3271, Acetobacter pasteurianum 5 IFO 3223, Gluconobacter suboxydans IFO 3172, Acetobacter turbidans IFO 3225, Acetobacter xylinum IFO 3288 vagy Xanthomonas citri IFO 3781 törzseket 2 napig ferde tenyészeten tenyésztünk, a kapott tenyészetekkel 3 térfogatrész „E" táptalajt oltunk be, és 10 az elegyet rázás közben 2 napon át 28 Cc -on tenyésztjük. A kapott fermentlevekkel 300—300 térfogatrész „C" táptalajt oltunk be, és az elegyet rázás közben 40 órán át 28 C°-on tenyésztjük. A sejteket centrifugálással elkülönítjük, 0,1 mólos citrát-foszfátpuffer oldattal (pH = 15 5,5) mossuk, 60 térfogatrész fenti pufFeroldatban szuszpendáljuk, amely 5 mg/ml 6-amino-penicillánsavat és 20 mg/ml D-fenilglicin-metilésztert tartalmaz, és a szuszpenziót rázás közben 1 órán át 37 C°-on inkubáljuk. 20 A képződött «-amino-benzil-penicillin mennyiségét a 3. táblázatban ismertetjük. 3. táblázat tx-amino-Mikroorganizmus -benzil-penicillin mg/ml Gluconobacter cerinus IFO 3263 3,5 Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3271 4,2 Acetobacter pasteurianum IFO 3223 3,2 Gluconobacter suboxydans IFO 3172 3,8 Acetobacter turbidans IFO 3225 2,5 Acetobacter xylinum IFO 3288 3,6 Xanthomonas citri IFO 3781 3,8 3. példa 40 Escherichia coli IFO 3210 törzset 2 napon át tenyésztünk, és 3 térfogatrész így kapott tenyészetet 300 térfogatrész „D" táptalajhoz adunk. Az elegyet rázás közben 48 órán át 37 C°-on tenyésztjük. A kapott fermentléhez 3,3 súlyrész kálium-penicillin-G 0,1 mólos fosz-45 fátpuffer-oldattal (pH = 6,0) készített oldatát adjuk, és az elegyet 16 órán át reagáltatjuk. A penicillin-G teljes mértékben elbomlik 6-amino-penicillánsavra és fenilecetsavra. A mikroorganizmus sejtjeit elkülönítjük, és a reakció-50 elegyhez 8 súlyrész D-fenilglicin-metilésztert és 6 súlyrész mosott Mycoplana sp. IFO 13213 sejtet adunk (a sejteket a „C" táptalajban az 1. kísérletben leírt módon végzett tenyésztés után különítjük el). Az elegyet rázás közben 1 órán át 37 C°-on inkubáljuk. A kapott elegy 55 4,5 mg/ml a-amino-benzil-penicillint tartalmaz. 4. példa 60 Fusarium solani IFO 8509 törzset 4 napig tenyésztünk, és 30 térfogatrész így kapott tenyészetet 1000 térfogatrész táptalajba töltünk. A táptalaj összetétele a következő: 3% szukróz, 0,2% nátriumnitrát, 0,1% dikálium-hidrogénfoszfát, 0,05% káliumklorid, 0,05% magnézi-65 umszulfát, 0,001% vas(II)szulfát és 0,05% fenoxiecet-6
