167856. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminopenicillinek előállítására
167856 10 mólos citrát-foszfátpuffer oldattal (pH = 5,5) mossuk, majd 60 ml fenti pufferoldatban szuszpendáljuk, amely 5 mg/ml 6-amino-penieillánsavat és 20 mg/ml D-fenilglicin-metilésztert vagy fenilecetsavat tartalmaz. A szuszpenziót rázás közben 1 órán át 37 C°-on inkubáljuk. 5 A képződött termékek elemzését a penicillin-származékok meghatározásának ismert módszerével végezzük. A biológiai meghatározásban vizsgálati mikroorganizmusként Staphylococcus aureus 209P-t alkalmazunk, és az eljárást az Antibiotics & Chemotherapy 3, 50—54 10 (1953) cikkben leírt módon hajtjuk végre. Az 1. táblázatban a fenti módszerrel elkülönített mikroorganizmusokat soroljuk fel. 1. táblázat 15 20 Mikroorganizmus Termelt vegyület a-amino-ben-mg/ml Penicillinzil-penicillin -G Mycoplana dimorpha IFO 13213 5,2 n. é. Acetobacter sp. IFO 13211 4,6 n. é. Acetobacter sp. IFO 13209 4,8 n. é. Acetobacter sp. IFO 13210 4,5 n. é. Aeromonas sp. IFO 13212 4,6 n. é. Xanthomonas sp. IFO 13215 4,2 n. é. Protaminobacter albofiavus IFO 13211 4,5 n. é. Megjegyzés: n. é.: = nem észlelhető; azaz a termék 0,01 mg/ml-nél kisebb koncentrációban képződik. A felhasznált táptalajok összetétele a következő: „A" táptalaj: Vízmentesített Bacto-Nutrient táptalaj (a Difco Laboratories, USA cég terméke) 0,8% Eurocidin* lOfAg/ml a-amino-benzil-penicillin 1 [Ag/ml Agar 2% B" táptalaj: D-fenilglicin-metilészter (vagy D-fenil-glicil-glicin) 0,1% Élesztőkivonat 0,01% MgS04 . 7 H 2 0 0,01% NH4NO3 0,004% K2 HP0 4 0,01% Karbamid 0,002% Eurocidin* 10fAg/ml Agar 2% C" táptalaj (pH =7,2): Húskivonat 1,0% Élesztőkivonat 0,5% Pepton 1,0% NaCl 0,5% D-fenilglicin-metilészter 0,05% D" táptalaj (pH =7,2): Húskivonat 1,0% Élesztőkivonat 0,5% Pepton 1,0% NaCl 0,5% Fenilecetsav 0,05% 25 30 35 40 45 50 55 60 65 „E" táptalaj (pH =7,2): Húskivonat Élesztőkivonat Pepton NaCl 1,0% 0,5% 1,0% 0,5% * a Takeda Chem. Ind. Ltd. (Japán) cég által előállított antibiotikum; tulajdonságait a J. Agr. Chem. Japan 29, 650 (1955) cikk ismerteti. 2. kísérlet Az Aeromonas sp. IFO 13212 törzs jellemzői Rövid pálcikák (0,6 X1—2 jx). A mozgás poláros ostorokkal történik. Gram-negatív. Agáron fejlődött telepek: körkörös, tompa sárga, domború, félig átlátszó. Agar-ferdetenyészet: fonalas, tompa sárga, sima. Fermentlé: zavaros, felhám észlelhető. Lakmusz-tej: savas, koagulál. Burgonya: sárgásbarna. Indol-vegyületeket termel. Nitrátokból nitriteket képez. Hidrogénszulfidot termel. Kataláz: pozitív. Sok szénhidrátból savat és gázt termel. A keményítőt hidrolizálja. Szabad, légköri nitrogént nem köt meg. 3. kísérlet (A) DL-1-ciklohexenil-glicin előállítása 4,4-súlyrész 1-ciklohexán-l-aldehid 8 térfogatrész metanollal készített oldatát 2 súlyrész nátriumcianid és 2,36 súlyrész ammóniumklorid 8 térfogatrész vízzel készült oldatához adjuk, és az elegyet 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután az elegyhez 20 térfogatrész vizet adunk. A kapott aminonitril-vegyületet 20 térfogatrész benzollal extraháljuk. A benzolos oldatot 3 X 10 térfogatrész 6 n sósavoldattal extraháljuk, és a vizes oldatot 2 órán át visszafolyatás közben forraljuk. A gyantás anyagot aktív szénnel eltávolítjuk, és a szűrletet 15 térfogatrészre betöményítjük. A koncentrátumot tömény vizes (28%-os) ammóniaoldattal pH~5-re lúgositjuk. A kivált nyers, kristályos DL-ciklohexenil-glicint leszűrjük és 1 n vizes nátriumhidroxid-oldatban oldjuk. Az oldathoz aktív szenet adunk, és az elegyet szűrjük. A szűrlethez térfogata felének megfelelő menynyiségű etanolt adunk, majd a szűrletet sósavval kb. 5,0 pH-ra savanyítjuk. Színtelen lemezek alakjában 1,1 súlyrész DL-1-ciklohexenil-glicin válik ki, o.p.: 242— 243 C°. Infravörös spektrum (KBr): 3160, 2960, 1605, 1490, 1400, 1345, 1274, 1145, 720 cm" 1. NMR spektrum (oldószer: 1 n NaOD): 1,5—2,4 (multiple«, 8H), 3,81 (szingulett, 1H, CH— COOH), 5,84 (multiple«, 1H, CH = C). (B) DL-1-ciklohexenil-glicin-metilészter előállítása 10 súlyrész DL-1-ciklohexenil-glicint 100 térfogatrész metanolban szuszpendálunk, és a szuszpenzióba kb. —15 C°-on 80 súlyrész tionilkloridot csepegtetünk. Az adagolás befejezése után az elegyet 3 napon át 4 C°-on állni hagyjuk. Az elegyet csökkentett nyomáson 5
