167856. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminopenicillinek előállítására
7 167856 8 cillin-szintézishez használhatjuk fel. A „feldolgozott fermentlé" megjelölésen olyan anyagokat értünk, amelyeket a fermentlének az aminopenicillin-szintetizáló aktivitás növelése és/vagy az enzimes reakció szempontjából kedvezőbb állapot elérése érdekében végzett kezelésével vagy kezeléseivel állítottunk elő. így pl. ha a fermentlé aminopenicillin-szintetizáló aktivitása a baktériumsejtek jelenlétének tulajdonítható, a fermentlé feldolgozásával pl. a következő termékeket állíthatjuk elő: (1) a fermentléből elkülönített sejteket mosás után különböző koncentrációjú pufferoldatokban szuszpendálva sejtszuszpenziókat készíthetünk; (2) a sejteket ismert extrahálási műveleteknek alávetve sejtkivonatokat állíthatunk elő; (3) a sejtkivonatokból ismert módon aminopenicillinszintetizáló aktivitással rendelkező, tisztított enzimkészítményeket állíthatunk elő stb. Ha a fermentlé aminopenicillin-szintetizáló aktivitása sejten kívüli anyagok jelenlétében tulajdonítható, a fermentlé feldolgozásával pl. a következő anyagokat állíthatjuk elő: (1) a fermentléből eltávolítjuk a sejteket, és így tiszta folyadékokat állítunk elő, (2) a folyadékokból ismert módon aminopenicillinszintetizáló aktivitással rendelkező, tisztított enzimkészítményeket állítunk elő stb. A (II) általános képletű a-helyettesített-a-aminosavszármazékok és a 6-amino-penicillánsav (I) általános képletű aminopenicillinekhez vezető kondenzációs reakciója során a kiindulási anyagokat a fent ismertetett fermentlével, vagy a fermentlé feldolgozása során kapott termékekkel hozzuk érintkezésbe, vizes közegben. A „vizes közeg" megjelölésen a leírásban és az igénypontokban olyan közegeket értünk, amelyek főkomponensként vizet tartalmaznak. Ennek megfelelően a vizes közeg kismennyiségű vízzel elegyedő szerves oldószert, pl. rövidszénláncú alkoholokat (így metanolt, etanolt vagy izopropanolt, acetont vagy hasonló anyagokat is tartalmazhat. A szerves oldószerek az elegy végtérfogatára számítva előnyösen 40 tf. %-nál kisebb, célszerűen kb. 20 tf. %-nál kisebb mennyiségben vannak jelen. A vizes közeg pH-értékét előnyösen kb. 4 és 8 közé, célszerűen kb. 5 és 7 közé állítjuk be. A reakcióidő a szubsztrátum koncentrációjától, a fermentlé vagy a feldolgozott fermentlé aminopenicillin-szintetizáló aktivitásától, a reakció hőmérsékletétől és hasonló tényezőktől függően változik, a reakciót azonban általában kb. 0,5—5 órán át végezzük. A reakcióelegy hőmérsékletét előnyösen kb. 10—50 C°-on, célszerűen kb. 20—40 C°-on tartjuk. A szubsztrátum koncentrációját elsősorban a felhasznált fermentlé vagy feldolgozott fermentlé aminopenicillinszintetizáló aktivitása szabja meg. A 6-amino-penicillánsavat általában a vizes közeg össztérfogatára számítva kb. 0,1—5 vegyes % koncentrációban, míg a (II) általános képletű a-helyettesített-a-aminosav-származékot kb. 0,1—10 vegyes % koncentrációban alkalmazzuk. A (II) általános képletű «-helyettesített-a-aminosavszármazékot előnyösen a 6-aminopenicillánsavhoz viszonyítva legalább ekvimoláris mennyiségben, előnyösen az ekvimoláris mennyiség legalább kétszeresében használjuk fel. A képződött (I) általános képletű aminopenicillineket könnyen elkülöníthetjük a reakcióelegytől. A termékeket ismert módon, enyhe körülmények között (pl. kromatográfiás eljárással) tisztíthatjuk. A találmány szerinti eljárás legjelentősebb előnyei a következők : 5 1. Az (I) általános képletű aminopenicillinek nagy hozammal állíthatók elő a (II) általános képletű a-helyettesített-a-aminosav-származékokból és 6-amino-penicillánsavból anélkül, hogy a penicillin-váz ß-laktam-gyurüje felhasadna. 10 2. Kiindulási anyagként a költséges 6-amino-penicillánsav helyett a penicillin-G penicillin-acilázokkal végzett kezelése során képződő, fenilecetsavat és 6-amino-penicillánsavat tartalmazó elegyet is felhasználhatjuk, a reakcióban ugyanis még akkor sem képződik penicillinig -G számottevő mennyiségben, ha az elegy fenilecetsavat is tartalmaz. 3. A felhasználandó mikroorganizmusok tenyésztése egyszerűen végrehajtható. 4. A képződött aminopenicillinek könnyen elkülönít-20 hetők a reakcióelegytől. Ennek megfelelően a találmány szerinti eljárás az (I) általános képletű aminopenicillinek ipari szintézisére igen előnyösen alkalmazható. Megjegyezzük, hogy az általunk vizsgált Pseudomo-25 nas törzseknél viszonylag erős ß-laktamaz-aktivitast tapasztaltunk. A találmány szerinti eljárást a következő kísérletekben és példákban részletesen ismertetjük anélkül, hogy az oltalmi kört azokra korlátoznánk. 30 Az 1. kísérletben a találmány szerinti eljárásban felhasználható egyik mikroorganizmus elkülönítését ismertetjük. A 2. kísérletben az 1. kísérletben leírt módon, folyóvízből elkülönített Aeromonas sp. IFO 13212 törzs jellemzőit adjuk meg. A 3. kísérletben a (II) általános 35 képletbe tartozó 1-ciklohexenil-glicin-metilészter előállítását ismertetjük. Ez a vegyület új anyag. Amennyiben egyebet nem közlünk, a példákban és a kísérletekben megadott %-értékek súly%-ot jelentenek, és a súlyrész/térfogatrész arányok g/ml arányoknak felelnek meg. 1. kísérlet 45 A találmány szerinti eljárásban felhasználható mikroorganizmusok elkülönítése Az „A" és „B" táptalajon egyaránt növekedő mikro-50 organizmusokat talajból, szennyvízből, tengervízből, folyóvízből, gyümölcsökből, illetve levegőből különítjük el. Az így elkülönített mikroorganizmusok közül a következőkben ismertetésre kerülő eljárással azokat a mikroorganizmusokat izoláljuk, amelyek fenilglicin-metil-55 észterből és 6-amino-penicillánsavból megfelelő aktivitással képeznek a-amino-benzil-penicillint, ugyanilyen körülmények között azonban fenilecetsavból és 6-amino-penicillánsavból csak csekély mennyiségű penicillin-G-t szintetizálnak. 60 Az elkülönített mikroorganizmusokat 2 napon át „E" táptalajon tenyésztjük. A kapott fermentléből 3 ml-t különítünk el, és ezzel az anyaggal Erlenmeyer-lombikba töltött 300 ml „C" vagy „D" táptalajt oltunk be. Az elegyet rázás közben40 órán át 28Cc -on tenyésztjük. A sej-65 tekét centrifugálással elkülönítjük a fermentlevektől, 0,1 4
