167750. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-demetil vindolin vagy N-demetil-vinblasztin előállítására vindolin vagy vinblasztin streptomyces albogriseolus-szal végzett demetilezésével
3 167750 4 ismert eljárások, mivel egyaránt használható vindolin és vinblasztin demetilezésére. Ha az előzőekben megadott II általános képletben R' hidrogénatom, a vegyületet vindolinnak, ha pedig R' a komplex indolil-csoporttal azonos, úgy a vegyületet vinblasztinnak nevezzük. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös kivitelezési változata szerint úgy járunk el, hogy a Streptomyces albogriseolus NRRL 5748 törzs tenyészetével egy vegetatív, kukoricalekvárt tartalmazó táptalajt oltunk, majd 30 C° hőmérsékleten 2—3 napon át rázóasztalon inkubáljuk a tenyészetet. Ezután 8—8% inokulummal pepton-aminos táptalajt tartalmazó lombikokat oltunk, majd rázóasztalon, 30 C° hőmérsékleten 24 órán át folytatjuk a tenyésztést. Ezután aceton és víz 1:1 arányú elegyében oldva hozzáadjuk a tenyészethez a vindolint vagy a vinblasztint. Az oldat 2 ml-e 50 mg alkaloidot tartalmaz. Mindegyik rázott tenyészet 150 ml táptalajból áll, az alkaloidot pedig olyan mennyiségben adjuk hozzá, hogy ez a 150 ml 50 mg-ot tartalmazzon. A fermentációt rázatás közben, 30 C° hőmérsékleten 5—6 napon át folytatjuk. Ezután savanyítjuk a tenyészetet, szűrjük, a szűrlet pH-ját 9 és 10 közötti értékre állítjuk be, majd a lúgos pH-jú szűrletben oldhatatlan alkaloid elkülönítésére egy vízzel nem elegyedő oldószerrel, például metiléndikloriddal extrahálunk. Az extraktum desztillációja után desztillációs maradékként kapott alkaloid-keveréket gradiens pH-extrakcióval, nagynyomású, alumíniumoxiddal végzett kromatográfiával, vagy más, az igen hasonló indol-alkaloidok elválasztására alkalmas eljárással elkülönítjük. A Streptomyces albogriseolus fermentációjával, szubsztrátként vindolint használva, más termékeket is előállíthatunk; ezeket Mailet és munkatársai (lásd előbb) leírják. A találmány szerinti új fermentációs eljárást a Streptomyces albogriseolus-szal (A 17178) vagy ennek egy morfológiai variánsával foganatosítjuk. A törzset a Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, törzsgyűjteményben letétbe helyeztük, ahol az az NRRL 5748 számot kapta. Ahogy az a témában jártas szakemberek előtt világos, a Streptomyces albogriseolus-tól morfológiai szempontokból különböző variánsok szintén demetilezik süllyesztett fermentációs körülmények között a vindolint vagy a vinblasztint. A találmány szerinti eljárást a következőkben példákkal szemléltetjük. 1. példa Az N-demetil-vindplin előállítása A Streptomyces albogriseolus (A 17178,5) törzset a következő összetételű kukoricalekvár-agaron (CSS XII) növesztjük: . Keményítőcukor 15 g Szójaliszt 15 g Kukoricalekvár (50% szárazanyag) 8 ml NaCl 5g CaC03 2g Csapvíz Hite A táptalaj pH-ját 6,0-ra állítjuk be, majd 25 percen át autoklávban sterilezzük. A kinőtt Streptomyces albogriseolus CSS XII ferdeagar tenyészettel 100 ml, 500 ml-es lombikokban sterile-5 zett, CSS XII táptalajt oltunk. A tenyésztést 30 C° hőmérsékleten, percenként 250-et forduló rázóasztalon végezzük. 72 órás rázatás után 8% inokulummal 150 ml, 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokban sterilezett, az alábbi összetételű PNZ táptalajt oltunk: 10 Keményítőcukor 25 g Oldható keményítő 10 g Pepton 40 g NZ Amin A (Skeffield 15 Chem. Co., New Jersey) 4 g MgSOá .7 H 2 0 5 g Melasz 5 g CaCOs 2 g Csapvlz 1 liter. 20 A táptalaj pH-ját 7,6-ra állítjuk be, majd használat előtt 25 percen át autoklávozzuk. A beoltott PNZ táptalajt 30 C° hőmérsékleten, percenként 250-et forduló rázóasztalon inkubáljuk. A tenyésztés 24. órájában 2 ml, aceton és víz 1: 1 arányú 25 elegyével készült oldatban 50 mg vindolint adunk a tenyészethez. 5 napon át folytatjuk a tenyésztést. Ezután 3,4-re állítjuk be a tenyészlé pH-ját és szűrjük. A szűrlet pH-ját 9 és 10 közötti értékre állítjuk be, és a bázikus oldhatatlan anyagokat, elsősorban a vindolint 30 és a vindolin fermentációs termékeit metiléndikloriddal extraháljuk. Vízmentesítjük a metiléndikloridos extraktumot és csökkentett nyomáson eltávolítjuk az oldószert. A desztillációs maradékként kapott alkaloid-keverék tisztítására a következőképpen járunk el: 35 Két gramm desztillációs maradékot benzolban oldunk, az oldatot 100 g szilikagélből készült, 3 cm átmérőjű oszlopon kromatografáljuk. Az eluálást 1,5 liter benzollal, benzol és etilacetát 95: 5 arányú elegyének 2 literével, benzol és etilacetát 3: 1 arányú elegyének 40 400 ml-ével, végül benzol és etilacetát 1: 1 arányú elegyének 1 literével végezzük. Az eluálást 1 liter, az utóbbi összetételű oldószerrel folytatva négy, összesen 95 mg, 102—104 C° hőmérsékleten olvadó N-demetil-vindolint tartalmazó frakciót kapunk. A termék a 45 3420cm_1 hullámhosszon az = NH-csoportra jellemző maximumot mutat, amely csoport a vindolinban nincs jelen. A termék mágneses magrezonancia spektruma szerint a 8 2,68 ppm mellett eredetileg látszó = N—CH3 protonok eltűntek és a S 4,50 (NH-dublett) és 8 4,15 50 (C—2 proton dublett) ppm mellett két új maximum jelent meg. A mágneses magrezonancia spektrum további részei a vindolin spektrumának megfelelőek. A találmány szerinti eljárással előállított vegyület kémiai szerkezetét tömegspektrumával is bizonyítjuk. 55 A tömegspektrum szerint számított molekulasúly a várttal azonos, az adott vegyülettípusnak megfelelő a fragmentációs kép is. 2. példa 60 Az N-demetil-vinblasztin előállítása Az 1. példában megadott eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy az NPZ táptalajjal készült 65 tenyészet 150 ml-éhez vindolin helyett 50 mg vinblasztint 2
