167747. lajstromszámú szabadalom • Eljárás halogénezett 7-feniltio-acetamido-CEF- 3-ÉM- 4-karbonsav- származékok előállítására
167747 3 4 az I általános képletű vegyületekkel gátolható, amely I általános képletben R a II általános képletű csoport, ahol R1 fluor- vagy klóratom; és ha R 1 fluoratom, akkor R2 és R 4 hidrogén- vagy klóratom és R3 hidrogénatom; és ha R 1 klóratom, akkor a) R2 hidrogénatom és R 3 vagy R 4 egyike klóratom, míg a másik hidrogénatom, vagy b) R2 klóratom és R 3 és R 4 hidrogén- vagy klóratom; R' hidrogénatom, diciklohexilamincsoport vagy gyógyszerészeti szempontból elfogadható kation. Amellett, hogy a fenti vegyületek a penicillináz enzimmel nem bonthatók, savakkal szemben ellenállók és patogén Gram-pozitív és több Gram-negatív mikroorganizmus növekedését gátolják, úgy találtuk, hogy különböző meticillin-rezisztens Staphylococcus aureus mikroorganizmus ellen hatásos antibiotikumként használhatók. A vegyületeket ismert módon állítjuk elő, és gyógyszerészeti szempontból elfogadható kationokkal képzett sóikként (karboxilcsoport) adagoljuk. A sóképzésre például nátrium-, kálium-, lítium-, ammónium- vagy szubsztituált ammóniumionokat, például metilammónium-, etilammóniumionokat használunk, de előállíthatunk vízben kevésbé oldódó sókat, például kalcium-, bárium-, prokain-, kinin-, ciklohexil-bisz-metilamin- vagy dibenziletiléndiaminsókat is. A fenti vegyületeket néha bisz-ciklohexilaminsóként különítjük el a reakcióelegyből, és ilyen alakban használjuk in vitro kísérletekben. A hatóanyagot előnyösen steril vizes, izotóniás sóval vagy dextrózzal készült oldatként, felnőtteknek 4—6 óránként 0,25 és 0,5 g közötti mennyiségben intramuszkuláris injekcióban adagoljuk. Orális adagoláskor a hatóanyag szintén felszívódik a vérbe, ilyenkor azt valamivel nagyobb adagokban, 4—6 óránként 0,50—1,0 g-os menynyiségben, tablettákban, zselatin kapszulákban vagy az ismert módon készített szuszpenziókban adagoljuk. Űgy találtuk, hogy meglepő módon, a fentiekben ismertetett vagyületek legtöbbje (a későbbiekben részletesen ismertetjük ezeket) emberi vérszérum jelenléte nélkül a szokásos módon kivitelezett agardiffúziós módszerrel vizsgálva, 11 ^g/ml-nél kisebb koncentrációban gátolja a meticillin-rezisztens Staphylococcus aureus növekedését. A vizsgálatok során Bryson és Szybalski 1952-ben ismertetett (Science, 45—46) módszerét alkalmaztuk. A penicillin-rezisztens Stapylococcus-ok kezelését Godzeski és munkatársai javaslata alapján végeztük (Antimikrobial Agents and Chemotherapy 1969, 547—554). A vizsgálatokhoz műanyag Petri-csészéket használunk. Mindegyik csészébe 10 ml agart öntünk, a Petri csészék egyik felét 5 mm magasra emeljük és az agart ilyen helyzetben hagyjuk megdermedni. Ez az alapréteg tartalmazza az antibiotikumot, a szérumot és/vagy más vizsgálandó anyagokat. A használt Difco Penessay Agar 2% agart tartalmaz. A „szérum-inaktivációs"-vizsgálathoz 4 ml emberi vagy lószérumot használunk. A szérumot a fedőréteghez is adhatjuk, abban az esetben szérum-gradiens nem jön létre, de a szérumot tartalmazó kétféle Petri-csészékkel kapott végső eredményekben sok antibiotikum vizsgálata után nem tapasztaltunk különbséget, így a szérumot a továbbiakban az alapréteghez adtuk. Miután az alsó, ferde agarréteg megdermedt, a csészéket vízszintes felületre helyezzük és mindegyikbe további 10 ml agart öntünk és hagyjuk megdermedni. A rezisztens Staphylococcus-okat tartalmazó inokulumot, ismert módon, a sejtek vizes szuszpenziójának öt-5 venszeres hígításával készítjük el. A hígítást 0,25%-os, steril vízzel vagy sóoldattal készült agárral végezzük. A Gram-negatív mikroorganizmusok inokulumát úgy állítjuk elő, hogy egy 16 órás tenyészetet 0,25%-os vizes agárral ötvenszeresre hígítunk. Az inokulumot egyenle-10 tes eloszlású baktérium-szuszpenzió készítése céljából erőteljesen rázzuk. A szélesztéshez 0,05%-os agart használunk, ezt 1 ml-es pipettával juttatjuk a már megdermedt agarrétegre. Kevés gyakorlattal gyorsan, egyenletesen szélesztett tenyészeteket készíthetünk. Az eljárás 15 alapja az agarréteg ferdére készítésében rejlik, ezt minden csészében azonosan és a lehető leggyorsabban kell elkészítenünk. A tenyészeteket 24 órán át 35—37 Cc hőmérsékleten inkubáljuk, majd leolvassuk a baktériumokkal benőtt 20 agarfelület (csík) hosszúságát, az eredményeket az egész agarréteg hosszúságának százalékában fejezzük ki és interpolációval meghatározzuk az agarréteg azon a helyén az antibiotikum koncentrációját. Úgy jártunk el, hogy egy, a Petri-csészék belső átmérőjének éppen megfe-25 lelő, 100 mm-es grafikont készítettünk, amelyben egy milliméter 1%-os antibiotikum-koncentrációnak felel meg. Több mérés átlagából számoljuk a legkisebb növekedésgátló koncentrációt, a rétegen két hosszan elhelyez-30 kedő baktériumtenyészet hosszúságát olvassuk le, és 2—3 csészét használunk egy-egy méréshez. Mindegyik lemezre nyolc, hosszában elhelyezkedő baktériumtenyészetet vihetünk. Ha a növekedés gátlásának pontos helye nem határozható meg, úgy a gátlási zóna kezdőpontja és a nö-35 vekedési szakasz végpontja közötti távolság felezőpontját vesszük alapul. A vizsgálat során különböző mennyiségű antibiotikumot tartalmazó Petri-csészéket használunk: 1. táblázat Koncentráció Petri-csésze (ig/ml száma 200 1. és 2. 100 3. és 4. 50 5. és 6. 20 ' 7. és 8. 10 9. és 10. 1 11. és 12. A fent ismertetett módon előnyösen vizsgálhatjuk a penicillinek és cefalosporinok baktériumellenes hatását. 55 A rezisztens Staphylococcus-ok ellen aktivitással rendelkező vegyületek vizsgálatakor, minden esetben, penicillint és stafcillint vagy prosztaflint, vagy más kontroll-antibiotikumot tartalmazó kontroli-csészéket is vizsgálunk. 60 A fent ismertetett gradiens-módszerrel az antibiotikumok között olyan különbségeket vehetünk észre, amelyek más, egyszerű szűrővizsgálattal nem derülnek ki. Az antibiotikumok hatása között megfigyelt különbségek például az állat-terápiás vizsgálatok során igaznak 65 bizonyultak. Úgy gondoljuk, hogy az agar-grádiens 2
