167703. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hordozóhoz kapcsolt penicillinaciláz előállítására

167703 nomerek keverékpolimerjeit alkalmazzuk. Ezekben az enzim kovalens kötésekkel van megkötve. Hordozóhoz kapcsolt, oldhatatlan, biológiailag aktív proteineket először a 3 167 485 sz. egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismertetett. Kísérletek folytak, hogy a penicillin-acilázt kovalens kötésekkel valamely polimer hordozóanyaghoz kapcsolják és ily módon a 6—APS előállításában felhasználják (1 917 057, 1 907 365 és 1 933 301 sz. NSZK-beli nyilvánosságrahozatali iratok). Az oldhatatlan penicillin-aciláz élőállítására irányuló, ezideig ismert módszerek azonban nem kielégítő megoldások, mivel az enzim a kapcsolás körülményei között biológiai aktivitásának nagy részét elveszíti, vagy a proteinnek csupán 50%-ánál kisebb mennyiségét sikerül a hordozóhoz kapcsolni. Hordozóhoz kapcsolt penicillin-acilázból az 1 917 057 sz. NSZK-beli nyilvánosságrahozatali irat szerint elérhető ugyan 50—60%-os hozam, ha polimer hordozóként valamely lineáris etilén-maleinsavanhidrid-polimert (EMA-gyanta) alkalmaznak, az alkalmazott polimer azonban nagyon inhomogén és a karbonsavanhidridcsoportok hidrolízise után semleges vagy lúgos kémhatású vizes közegben oldható. Csak az enzimei, valamint egyéb di- vagy poliaminokkal, amelyek több helyen kopolimerként kötődnek, válik térhálós szerkezetűvé, és ezáltal vízoldhatatlanná. A kismolekulájú és részben vízoldható frakciókat nem lehet elválasztani. Ezért a kötött protein egy része oldható anyagként kárba vesz. Azonkívül magasabb proteinkoncentrációk az EMA-gyantában olyan erős térhálósítást hoznak létre, hogy a penicillin szubsztrátum a gyantát csak részben hatolhatja át. A 6 804165 sz. dél-afrikai köztársaságbeli leírás szerint cianur-kloriddal vagy diklóro-s-triazinil-kloriddal aktivált cellulózhoz kapcsolják a penicillin-acilázt. A leírásban megadott körülmények között az enzimproteineknek csak 64%-a kapcsolódik a cellulózhoz. A cellulózhoz kapcsolt enzim aktivitása a szabad enzim aktivitásának csupán 25—35%-a, úgyhogy a hordozón a kiindulási enzimaktivitásnak már csak 16—22%-a érvényesül (lásd: Self D. A., Kay G., Lilly M. D.: Biotechnology and Bioengeneering. Vol. XI. 337—348 [1969]). Az 1 908 290 és 1 935 711 sz. NSZK-beli közrebocsátási irat akrilamid, maleinsav és N,N'-metilén-bisz-akrilamid monomerekből képzett, erősen duzzasztható keverékpolimerekkel foglalkozik. Ezek a kevésbé térhálósított polimerek a proteint kíméletesen kötik, így a proteinszerkezet és ezzel az enzimes aktivitás a kötés után is megmarad. Az enzimek aminocsoportjai a polimer anhidridcsoportjaival reagálnak. Mivel azonban a szolvolízis által is, a karbonsavamid képződésével együtt is szabad karboxilcsoportok keletkeznek, előfordulhat, hogy a protein nemcsak kovalens, hanem heteropoláris módon is kapcsolódik. így az 1935 711 sz. NSZK-beli közrebocsátási iratban megadot feltételekből kivehető, hogy a tripszinnek maximálisan 50%-a kovalens kötéssel, a többi 50%-a heteropolárisan van megkötve. Az enzim heteropolárisan kötött része azonban a későbbi reakciók során a változó sókoncentrációk és pH értékek hatására leoldódik, csökkenti a kötött enzim hozamát és szennyezi a terméket. Hordozóhoz kapcsolt penicillin-acilázra a fenti közrebocsátási irat nem tartalmaz kitanítást. A találmány szerinti eljárással ezek a hátrányok kiküszöbölhetők, a találmány szerinti keverékpoli-5 merek a penicillin-acilázt 98% mennyiségig kovalens kötéssel kötik meg. A találmány szerinti, kovalens kötéssel a hordozóanyaghoz kapcsolt penicillin-aciláz nagyüzemű eljárásban a penicillin enzimes hasítására alkalmaz-10 ható. A hordozóanyagon kötött enzim minden alkal- ' mazás után szűréssel vagy centrifugálással könnyen visszanyerhető és újra felhasználható. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott keverékpolimert önmagában ismert módon állíthatjuk 15 elő. Polimerizáció után a gélszerű gyanát 0,5 mm lyuknagyságú szitán áttörjük, jól megmossuk, majd vákuumban szárítjuk. A belepolimerizált dikarbonsavat 2 órán át 180 °C-on melegítve dikarbonsavanhidriddé alakítjuk. 2 óránál hosszabb melegítés nem 20 célszerű, mert akkor a keverékpolimer kötőkapacitása észrevehetően csökken. A keverékpolimer proteinkötő kapacitása a meglevő anhidridcsoportok számától, valamint a pórusok méretétől függ. Erősebben térhálósított termék 25 esetén a kötőkapacitás kisebb, mint kevésbé térhálósított polimer esetén. A kevésbé térhálósított polimer erősebben duzzasztható, egyidejűleg a kopásállósága csökken. A penicillin-aciláz kovalens kötésére előnyösen 45 30 rész akrilamid, 3 rész N,N'-metilén-bisz-akrilamid és 15 rész maleinsav monomerekből állítjuk elő a polimert [a kiindulási anyagok például az E. Merck (Darmstadt) cégtől szerezhető be]. A penicillin-aciláz aminocsoportjai 5,0 és 6,5 közötti pH-tartomány-35 ban, előnyösen 5,8 pH-értéknél reagálnak a polimer anhidridcsoportjaival. Mivel a ciklikus anhidridcsoportok szolvolízise által enyhén savas kationcserélő gyanta keletkezik, a reakcióelegy kémhatása egyre lúgosabbá válik, hacsak folyamatosan nem adago-40 lünk hozzá híg alkálilúgot. Előnyösen pH szabályozó készüléket alkalmazunk. A reakciófeltételek pontos betartása a kötött penicillin-aciláz hozamára nézve igen fontos. A hozam a pontos pH-érték függvénye. Így 5,8 pH-érték esetén 98%, 6,5 pH-érték ese-45 tén 45% és 4,5 pH esetén csupán 22% enzim kapcsolódik. A reakció hőmérséklete szintén fontos. Lehetőleg alacsony hőmérsékleten dolgozunk. Magasabb hőmérséklet esetén a ciklikus anhidridcsoportok hidro-50 lízise gyorsabban zajlik le, mint az ammonolízise. Előnyösen +4 °C-os hőmérsékleten valósítjuk meg a reakciót. A kapcsolás azonkívül az ionerősségtől függ, előnyösen alacsony ionerősséggel rendelkező pufferol-55 dalokban hajtjuk végre a reakciót. Magas koncentrációjú pufferoldatokban a polimer zsugorodik, ennek következtében az enzim lassabban hatolhat be a polimer hálójába, és lassabban reagál. Előnyösen 0,01—0,05 m foszfátpuffer-oldatot alkalmazunk. A 60 kapcsolás után a kötött penicillin-acilázt tartalmazó hordozót leszűrjük és először vízzel, majd 1 m nátriumklorid-oldattal alaposan mossuk. 1 g enzimre számítva legalább 10 g keverékpolimert alkalmazunk. Először körülbelül 3—4 g poli-65 mert adunk az enzim 250 ml 0,05 mólos, 5,5 pH-2