167703. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hordozóhoz kapcsolt penicillinaciláz előállítására
5 167703 6 já foszfátpufferrel készített oldatához, az oldatot erélyesen keverjük, majd két óra elteltével a polimer fennmaradt részét kis adagokban adjuk hozzá. A reakció teljes időtartama alatt a pH-értéket híg nátriumhidroxid-oldat hozzáadásával állandó értéken tartjuk. Ha a polimer feletti vizes fázis 5 óra eltelte után még szabad enzimet tartalmaz, további keverékpolimert adunk hozzá. Ha 1 rész enzimre számítva 15—20 rész keverékpólimert alkalmazunk, a reakció általában teljesen megy végbe. A találmány szerinti hordozóhoz kapcsolt penicillin-aciláz tárolás alatt nem veszít az enzimes hatékonyságából. A hordozóhoz kapcsolt penicillin-aciláz enzimes aktivitásának meghatározása céljából azt milliméterenként 30 000 NE penicillin G-káliumot tartalmazó oldattal 37 °C-on inkubáljuk. A 7,8 pH-értéket betartva a felszabadított fenilecetsavat n/10 nátriumhidroxid-oldattal titráljuk. Egy enzim-egység (E) az az aktivitás, amely ezek között a körülmények között percenként 1 (imól penicillin G-t 6-aminopenicillánsavvá és fenilecetsavvá hasít. A találmányt az alábbi példákkal szemléltetjük: 1. példa A keverékpolimer előállítása a) 450 g akrilamid, 22,5 g N,N'-metilén-bisz-akrilamid és 150 g maleinsav 3500 ml 0,05 mólos, 7,6 pH-jú foszfátpufferrel készített oldatához nitrogénlégkörben 150 ml 5%-os vizes propionsavnitril-oldatot és 150 ml 5%-os ammóniumperoxidiszulfát-oldatot adunk. A reakcióelegyet 80 °C-ra felhevítjük, utána 15 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, majd 0,5 mm nagyságú szitán keresztültörjük. A polimert vízzel gondosan megmossuk, utána liofilizáljuk, majd 20 Hgmm nyomáson 2 óra hosszat 180 °C-on tartjuk. Azonos módon eljárva az alábbi mennyiségű alapanyagokból keverékpolimereket állítunk elő: b) 450 g akrilamid, 30 g N,N'-metilén-bisz-akrilamid és 150 g maleinsav. c) 450 g akrilamid, 45 g N,N'-metilén-bisz-akrilamid és 150 g maleinsav. d) 450 g akrilamid, 45 g N,N'-metilén-bisz-akrilamid és 75 g maleinsav. e) 450 g akrilamid, 135 g N,N'-metilén-bisz-akrilamid és 150 g maleinsav. A polimereket az la) példában leírt módon dolgozzuk fel. 2. példa Hordozóhoz kapcsolt penicillin-aciláz előállítása a) 1,0 g 15 E/mg fajlagos aktivitású penicíllin-aci-S láz 200 ml 0,01 mólos, 5,8 pH-jú foszfátpufferrel készített oldatához 4 °C-ön keverés közben 5 óra alatt kisebb adagokban összesen 15 g, az la) példa szerint előállított keverékpolimert adunk. (A fószfátpuffert úgy készítjük, hogy literenként 8,895 g 10 Na2 HPCv, • 2H 2 0-t tartalmazó vizes oldatból 79 ml-t és literenként 6,805 g K^PCVet tartalmazó oldatból 921 ml-t összekeverünk.) A pH-értéket híg nátriumhidroxid-oldattal 5,8-on tartjuk. Az elegyet 24 órán át 4 °C-on állni hagyjuk, majd a penicillin-acilázt 15 tartalmazó hordozót kiszűrjük és 300 ml vízzel megmossuk. A hordozóhoz kapcsolt, nedves enzim súlya duzzasztott állapotban 300 g, a fajlagos aktivitás 0,049 E/mg, ami a kovalens kötésű penicillin-aciláz 98%-os hozamának felel meg. 20 b) 15 g, az lb) példa szerint előállított keverékpolimert a 2a) példában leírt módon 1 g 15 E/mg aktivitású penicillin-acilázzal reagáltatunk. 290 g nedves, hordozóhoz kapcsolt, 0,044 E/mg aktivitású enzimet kapunk. A kovalens kötéssel kapcsolt pe-25 nicillin-aciláz hozama ez esetben 85%. c) 15 g, az le) példa szerint előállított keverékpolimert a 2a példában leírt módon 1 g 15 E/mg aktivitású penicillin-acilázzal reagáltatunk. 295 g nedves, hordozóhoz kapcsolt, 0,039 E/mg aktivitású en-30 zimet kapunk, ami azt jelenti, hogy a kovalens kötéssel kötött penicillin-aciláz hozama 77%. d) 15 g, az ld) példa szerint előállított keverékpolimert a 2a) példában leírt módon 1 g 15 E/mg aktivitású penicillin-acilázzal reagáltatunk. 280 g ned-35 ves, hordozóhoz kapcsolt, 0,041 E/mg aktivitású enzimet kapunk, ami a kovalens kötéssel kapcsolt penicillin-aciláz 76,5%-os hozamának felel meg. e) 15 g, az le) példa szerint előállított keverékpolimert a 2a) példában leírt módon 1 g 15 E/mg ak-40 tivitású penicillin-acilázzal reagáltatunk. 65 g nedves, hordozóhoz kapcsolt, 0,146 E/mg aktivitású enzimet kapunk, ami azt jelenti, hogy a kovalens kötéssel kötött penicillin-aciláz hozama 63%. A kiindulási anyagként alkalmazott penicillin-aci-45 lázt például az alábbiak szerint állíthatjuk elő: Az ATCC 11 195 sz. E. coli törzs sejtjeit az 1 111 778 sz. NSZK-beli szabadalmi leírás szerint fenilecetsav jelenlétében tenyésztjük. A tenyészetet centrifugálással eredeti térfogatának egytized részé-50 re betöményítjük, és a sejteket 3% metilizobutilketon jelenlétében 7,5 pH-n 3 órán át keverve feltárjuk. A feltárt sejtszuszpenzió pH értékét kénsavval 5,0-ra állítjuk és tisztára centrifugáljuk. A felülúszó részt sómentesített vízzel hígítva a fajlagos vezető-55 képességet 5 mS/cm értékre állítjuk be. Az oldathoz a penicillin-aciláz adszorpciójához éppen elegendő mennyiségű, mintegy 6 g B II típusú bentonitot (az Erbslöh cég gyártmánya) keverünk. 30 perc elteltével a bentonitot lecentrifugáljuk, majd ötszö-60 rös térfogatú, 8,0 pH-jú 0,5 M nátriumfoszfát-oldattal eluá) juk. A lecentrifugálással kapott, a penicillin-acilázt tartalmazó eluátum pH értékét 6—7 állítjuk, az eluátumot sómentesített vízzel szemben díalízáljük. A fagyasztva szárított termék enzimak-65 tivitása 15 E/mg. 3
