167655. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-terminálisán alfa-aminooxikarbonsavat tartalmazó, új, ACTH hatású polipeptidek előállítására
17 167655 18 (BOC) -Prp-Val- Gly-OH.HCl-ot, 0,400 g (0,176 mmol) H-Lys(BOC) -Lys(BOC) -Arg-Arg-Pro-Val-Lys (BOC)- Val-Tyr (Bu^-Pro-Asp (OBu*) -Ala-Gly-Glu (OBu*) -OBut.3 HCl-ot és 0,281 g (1,05 mmol) PCPOH-t feloldunk 3,3 ml dimetilformamidban, és hozzáadunk 0,025 ml (0,18 mmol) trietilamint, majd 0,074 g (0,36 mmól) DCC-t. A reakcióelegyet 2 napig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd a DCU-t kiszűrjük és a szűrletet 30 ml éterrel hígítjuk. A kivált terméket leszűrjük, éterrel mossuk, szárítjuk. 0,673 g (90,7%) védett, aminooxikarbonsawal helyettesített öktaközapeptid-trihidrokloridot kapunk; op.: 158-162 G°,R|_Q 25 6. példa H-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu—His-Phe-Arg-Trp-Cly-Lys - Pro- Val-Gly-Lys-Lys-Arg— Arg-Pro-Val -Lys-Val-Tyr-Pro -Asn-Gly-Ata -Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-ÖH 1,00 g (0,214 mmól) BQC-D-ÓSer-^Tyr- Ser-Met-Glu (OBu*) -His-Phé-Arg-Trp-Gly-Lys (BOC) Pro-Val- Gly-Lys(BOC)-Lys (BOC)- Arg-Arg -Pro-Val-Lys(BOC>- Vál-Tyr (Bú*) -Pro-Asn-Gly-Ala-Glu (OBu^-Asp (OBu^-GluíOBu1 ) -Ser-Ala-OBut.3 HCl-ot feloldunk 8 ml trifluorecetsav, 1 ml víz és 1 ml anizol elegyében. Az oldatot 1 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd 200 ml éterrel hígítjuk. A kivált csapadékot szűrjük, éterrel mossuk, foszforpentoxid és káliumhidroxid mellett vákuumban szárítjuk. 0,90 g (88%) aminooxikarbonsawal helyettesített dotriakontapeptid-tri fluoracetátot kapunk. A nyers trifluoracetátot 20 ml vízben oldjuk, a trifluoracetát ionokat acetát ciklusú Dowex 1x8 ioncserélő gyantával acetát ionokra cseréljük. Az így kapott aminooxikarbonsawal helyettesített dotriakontapeptid-acetát oldatot Whatman CM-52 ioncserélőből készített 5,0x83 cm-es oszlopra öntjük, majd 3 liter 0,01 mólos (pH 4,5) és 3 liter 0,4 mólos (pH 6,7) ammóniumacetát pufferból készült lineáris puffergradienssel eluáljuk. A kívánt anyagot tartalmazó 133-151. frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. 0,46 g (46%) aminooxikarbonsawal helyettesített dotriakontapeptidet kapunk. Rf = 0,18. A kiinduló anyagként használt védett, aminooxikarbonsawal helyettesített dotriakontapeptid-trihidrokloridot az alábbi módszerrel készítjük. 1. lépés Z-Glu (OBuVSer-Ala-OBu* 23,9 g (100 mmól) Z-Ser-OH-t és 14,5 g (100 mmól) H-Ala-OBut-t feloldunk 150 ml metüénkloridban, az oldatot -10 C°-ra hűtjük és -10 C°-on hozzácsepegtetjük 20,6 g (100 mmól) DCC 100 ml metilénkloridos oldatát. A reakcióelegyet 2 órán keresztül 0 C°-on keverjük, majd szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Másnap a kivált DCU-t kiszűrjük és a szűrletet 3x70 ml n sósawal és 3x70 ml 5%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal kirázzuk. A metilénkloridos oldatot szárítás után bepároljuk, az olajos maradékot 50 ml etilacetátban feloldjuk és az oldatot 4 órán át 0 C°-on állni hagyjuk. A kivált DCU-t kiszűrjük a szűrletet bepároljuk és az olajos maradékot n-hexánnal megszilárdítjuk. Az így nyert 30,0 g (82%) nyers Z-Ser-Ala-OBut-t 600 ml metanolban feloldjuk, és 2 g 10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A reakció befejeződése után a katalizátort kiszűrjük és az oldatot 5 bepároljuk. A kapott H-Ser-Ala-OBat-t 220 ml etilacetátban feloldjuk, majd 33,0 g (76 mmól) Z-Glu(OBu*)- ONSu-val reagáltatjuk. Másnap a reakcióelegyet háromszor 50 ml n sósawal, háromszor 50 ml nátriumhidrogénkarbonát oldattal kirázzuk. Az 10 etilacetátos oldatot szárítás után bepároljuk és a maradékot petroléterrel eldörzsöljük. A nyers terméket etilacetátban oldjuk, az oldathoz petrolétert adunk és a csapadékot kiszűrjük, majd megszárítjuk. 31,5 g (75%) Z-GluíOBut) -Ser-Ala-OBut-t nye-15 rünk; op.: 72-74 C°, Rf4 « 0,6. Elemzés C2 7 H41N3O9 összegképlet alapján: számított: C 58,8%; H 7,5%; N 7,65%; talált:C 58,8%; H 7,7%; N 7,8%. 20 2. lépés: H-GMOBuVSer-Ala-OBu*) 25 16,0 g (29,0 mmól) Z-GMOBu^-Ser-Ala-OBut-t 350 ml metanolban oldunk és 1,6 g 10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A reakció befejeződése után a katalizátort kiszűrjük, az oldószert ledesztilláljuk és a mára-30 dékot metanol-éterből átkristályosítjuk. 9,06 g (75%) tripeptidet kapunk; op.: 135-136 °C R^ =0,15 [a]D =-25,9° (c = l, etanol). Elemzés aCi9H3s N 3 0 7 összegképlet alapján: 0 számított: C 54,6%; H 8,5%; N 10,1%; 35 talált:C 54,5%; H 8,4%; N 9,8%. 3. lépés: Z-Asp (OBut)-Glu (OBuVSer-Ala -OBu* 8,2 g (19,6 mmól) H-GluíOBu^-Ser-Ala-OBut-t és 8,0 g (19,0 mmól) Z-AspíOBu^-ONSu-t 80 ml etilacetátban oldva reagáltatunk. Másnap a reakció._ elegyet háromszor 20 ml n sósawal és háromszor 20 ml 5%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal kirázzuk. Az etilacetátos oldatot szárítás után bepároljuk, és a maradékot petroléterrel eldörzsöljük. 12,08 g (85,5%) védett tetrapeptidésztert kapunk; op.: 85-87 C°, 50 Rf 4 =0.55. Elemzés a C3sH54 N 4 0i2 összegképlet alapján: számított: N 7,3%; talált:N 7,8%. 55 4. lépés: H-Asp(OBut )-Glu<OBu t )-Ser-Ala-OBu t 60 10,5 g (14,5 mmól) Z-AspíOBu^-GluíOBu*) -Ser-Ala-OBut-t 130 ml metanolban feloldunk és 1 g 10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezünk. A reakció befejeződése után a katalizátort kiszűrjük, az oldatot bepároljuk és a 65 maradékot petroléterrel szűrőre visszük. 8,35 g (97,5%) tetrapeptidésztert kapunk; pp.: 80-81 C , R4 = 0,1 [a]D = _24,3° ( c = 1, etanol). 9
