167655. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-terminálisán alfa-aminooxikarbonsavat tartalmazó, új, ACTH hatású polipeptidek előállítására
167655 11 12 kozapeptidet kapunk; peptid tartalom: 75% (UV elnyelés alapján), Met-szulfoxid tartalom: 2,57%, Tyr/Trp arány: 2,07, aminosavanalízis: Lys 4,35 (4), His 0,97 fi), Arg 3,13 (3), Asp 1,06 (1), Ser 1,00 (1), Glu 1,92 (2), Pro 2,90 (3), Gly 3,00 (3), Ala 1,00 (l),6Val 2,92 (3), Met 0,87 (1), Tyr 2,21 (2), Phe 1,06 (1), Rf = 0,29. A kiindulóanyagként használt védett, aminooxikarbonsawal helyettesített oktakozapeptid-trihidrokloridot az alábbi módszenei készítjük; 1. lépés: terc-Butiloxikarbonil-D-alfa-aminooxipropionsav (BOC-D-OAIa-OH) 7,04 g (51 mmól) L-alfa-brómpropionsavat, 6,3 g (112 mmól) káliumhidroxidot és 7,71 g (58 mmól) tercbutiloxikarbonil-hidroxilamint az 1. példa- 1. lépés szerint reagáltatunk és dolgozunk fel. A nyers terméket feloldjuk éterben és 11,0 ml (56 mmól) diciklohexilamint adunk hozzá. így 14,85 g (75%) terc-butiloxikarbonil-D-alfa-bróm- propionsav-diciklohexüaminsót kapunk, op.: 157 C°. A diciklohexilaminsó éteres szuszpenzióját 0,2 n kénsawal rázva, majd az éteres réteget bepárolva 6,55 g (62%)terc-butiloxikarbonil-D-alfa-aminooxipropionsavat kapunk, op.: 110-111 C°, ^]^5 = + 90,0 (c=l, etanol). 2 lépés: BOC-D-OAIa-Tyr -Ser -Met -N2 H 3 1,85 g (9,0 mmól) BOC-D-OAla -OH-t és 4,50 g (10 mmól) H-Tyr-Ser -Met-OCH3 .HCl-ot feloldunk Í5 ml dimetilformamidban. Az oldatot 0 C°-ra hűtjük és hozzáadunk 1,11 ml (10 mmól) N-metilmorfolint, majd 1,90 g (9,2 mmól) DCC-t. A reakcióelegyet 1 órán keresztül 0 C°-on keverjük, majd másnapig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután a DCU-t kiszűrjük, a szűrletet bepároljuk és a maradékot 200 ml etilacetátban oldjuk. Az oldatot kétszer 100 ml n sósavval, kétszer 100 ml 8%-os nátriumhidrogénkarbonát-oldattal kirázzuk, majd szárítás után bepároljuk. A géles maradékot (3,65 g védett helyettesített tetrapeptid észter) 40 ml metanolban feloldjuk, 1,02 ml (21,2 mmól) hidrazinhidrátot adunk hozzá és a reakcióelegyet másnapig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Másnap a gelesen kivált termékről a metanolt ledesztilláljuk, a maradékot etilacetáttal eldörzsöljük, szűrjük, etilacetáttal, éterrel mossuk és tömény kénsav meleltt szárítjuk. 1,90 g (35%) védett, aminooxikarbonsawal helyettesített tetrapeptid-hidrazidot kapunk; op.: 184-185 C° (vízből átkristályosítva) Rjí = 0,43. Elemzés a C2 s H4oN 6 0 9 S összegképlet alapján: számított: C 50,0%; H 6,7%; N 14,0%; talált:C 49,8%; H 6,6%; N 14,1%. 3. lépés BOC-D-OAIa-Tyr-Ser-Met-Glu(OBuV His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-OH. HCL 0,381 g (0,635 mmól) BOC-D-OAla- Tyr-Ser—Met—NjHVot feloldunk 4,5 ml dimetilformamidban. A -20 C -ra hűtött oldatba keverés közben becsepegtetünk 0,58 ml (2,65 mmól) 4,4 n etilacetátos sósav oldatot, majd 0,095 ml (0,80 mmól) terc-butünitritet. A reakcióelegyet ezután 5 percig -10 C°-on keverjük, majd -20 C°-ra hűtjük és hozzáadjuk 0,86 g (0,628 mmól) H-GluíOBut) -His-Phe -Arg-Trp -Gly-Lys(BOC)-Pro- Val-Gly-OH és 0,43 ml (2,50 mmól) 5 diizopropil-etilamin 7,2 ml dimetilformamidos oldatát. A reakcióelegyet 1 órán keresztül -5 és 0 C° közötti zőmérsékleten keverjük, majd másnapig 0 C°-on állni hagyjuk. Ezután a dimetilformamidot ledesztilláljuk, a maradékot 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal el-10 dörzsöljük. Szűrés, vizes mosás, szárítás után 0,95 g (77%) védett, aminooxikarbonsawal helyettesített tetradekapeptidet kapunk. 1,35 ml tömény sósav és 1,35 ml piridin elegyítésével piridin-hidroklorid oldatot készítünk és hozzáadjuk a 6 ml metanolban szuszpendált 15 védett, aminooxíkarbonsawal helyettesített tetradekapeptidhez. Az így kapott oldatot 50 ml vízzel hígítjuk, a kivált csapadékot szűrjük, vízzel mossuk és szárítjuk. 0,78 g (63%) védett, aminooxikarbonsawal helyettesített tetradekapeptid-hidrokloridot kapunk, op.: 20 204-210 C°,R| =0,20. 4. lépés: BOC-D-OAIa-Tyr -Ser-Met-Glu (OBüVhlis -Phe-Arg-Trp- Gly-Lys(BOC)- Pro-Val -Gly-25 Lys(BOC)-Lys (BOO-Arg -Arg-Pro-Val-Lys^ (BOO-Val-TyrlBu*) -Pro-Asp (OBuV Ala-Gly-Glu (OBu^OBu* 0,348 g (0,176 mmól) BOC-D-OAla- Tyr-Ser-30 -Met-Glu (OBu^-His-Phe- Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val- Gly-OH.HCl-ot, 0,400 g (0,176 mmól) H-Lys(BOC)-Lys(BOC) -Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val -Tyr(But) -Pro-Asp (OBu^-Ala -Gly-Glu (OBu^OBu^ HCl-ot és 0,281 g (1,05 mmól) 35 PCPOH-t feloldunk 3,3 ml dimetilformamidban és hozzáadunk 0,025 ml (0,18 mmól) trietÜamint, majd 0,074 g (0,36 mmól) DCC-t. A reakcióelegyet 2 napig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd a DCU-t kiszűrjük és a szűrletet 30 ml éterrel hígítjuk. A kivált terméket 40 leszűrjük, éterrel mossuk, szárítjuk. 0,647 g (87,5%) védett, aminooxikarbonsawal helyettesített oktakozapeptid-trihidrokloridot kapunk: op.: 166-167 C°, Re = 0,25. ^ 4. példa H-OSer- Tyr-Ser-Met -Glu-Hís -Phe-Arg-Trp-Gly-Lys -Pro-Val-Gly-Lys-Lys- Arg-Arg-Pro-50 Val-Lys-Val- Tyr-Pro- Asp-Ala-Gly-Glu-OH 0,600 g (0,142 mmól) BOC-OSer-Tyr-Ser-Met -Glu(OBut)-His -Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val- Gly-Lys (BOC)-Lys (BOC>-Arg — 55 Arg-Pro-Val-Lys (BOCWal -Tyr-ÍBut^-Pro -Asp(OBu^-Ala-Gly-GluíOBuVoBub HCl-ot feloldunk4,8 ml trifluorecetsav, 0,6 ml víz és 0,6 ml anizol elegyében. Az oldatot 1 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd 60 ml éterrel hígítjuk. A kivált csapadékot szűrjük, 60 éterrel mossuk, foszforpentoxid és káliumhidroxid mellett vákuumban szárítjuk. 0,400 g (65%) aminooxikarbonsawal helyettesített oktakozapeptid-trifluoracetátot kapunk. A nyers trifluoracetátot 8 ml vízben oldjuk, a trifluoracetát-ionokat acetát-ciklusú Dowex 1x8 ion cserélő gyantával acetát-ionokra cseréljük. Az így kapott
