167655. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-terminálisán alfa-aminooxikarbonsavat tartalmazó, új, ACTH hatású polipeptidek előállítására
13 167655 14 oktakozapeptid-acetát-oldatot Whatman CM-52 ioncserélőből készített oszlopra öntjük, majd 0,01 mólos (pH 4,5) és 0,4 mólos (pH 6,7) ammóniumacetát pufferből készült lineáris puffergradienssel eluáljuk. A kívánt anyagot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és liofilizáliuk. 0,240 g (41,5%) aminooxikarbonsawal helyettesített oktakozapeptidet kapunk; peptid tartalom: 81,6% (UV elnyelés alapján), Met-szulfoxid tartalom: 4,4%, Tyr/Trp arány: 2,13, aminosavanalízis: Lys 3,92(4), His 1,00(1), Arg 3,15(3), Asp 0,99(1), Ser 0,83(1), Glu 1,94(2), Pro 3,00(3), Gly 3,05 (3), Ala 1,04(1), Val 2,92(3), Met 0,79(1), Tyr 1,83(2), Phe 0,97(1). A kiinduló anyagként használt védett, aminooxikarbonsawal helyettesített oktakozapeptid-trihidrokloridot az alábbi módszerrel készítjük: 1. lépés: terc-Butiloxikarbonil-L-alfa-aminooxi-béta-benziloxipropionsav 48,4 g (0,364 mól) terc-butiloxikarbonil-hidroxilamint, 40,7 g (0,728 mól) káliumhidroxidot és 94,0 g (0,364 mól) DL-alfa-bróm-béta -benziloxipropionsavat 360 ml vízben oldunk és a reakcióelegyet 3 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután az oldat pH-ját 3-ra állítjuk és háromszor 720 ml éterrel kirázzuk. Az éteres oldatot 720 ml vízzel rázzuk ki, majd szárítás után 78 ml (0,40 mól) diciklohexilamint adunk hozzá. A kapott 43,61 g terc-butiloxikarbonil-DL-alfa-aminooxi- béta-benziloxipropionsav diciklohexilaminsót (op.: 144-146 C ) 500 ml éterben szuszpendáljuk és ötször 100 ml 0,2 n kénsawal rázzuk ki. Az éteres oldatot szárítás után szárazra pároljuk, a maradékot 700 ml etanolban oldjuk és 6,56 g (48,5 mmól) (+)-amfetamin-bázist adunk hozzá. Az oldatot éjjelen át hidegen állni hagyjuk, a kivált kristályokat szűrjük. Az anyalúg bepárlásával 9,33 g (16,5%) terc-butiloxikarbonü- L-alfa-aminooxi-béta- benziloxipropionsavat kapunk, op.: 95—97 C0, [a]i) 8 = -36° (c = l, etanol). 2. lépés: terc-Butiloxikarbonil- L-alfa-aminooxi-béta- hid roxipropionsav (BOC—OSer-OH) 5,0 g (16,1 mmól) L-alfa-terc-butiloxikarboniíaminooxi-béta -benziloxipropionsavat feloldunk 100 ml metanolban és 2,5 g 10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. 3 óra után & katalizátort kiszűrjük és a metanol ledesztillálása után visszamaradó olajat petroléter atett állni hagyjuk. A termék néhány óra alatt kikristályosodik. Szűrés, szárítás után 3,2 g (90%) L-alfa-terc-butiloxikarbonilbéta-hidroxipropionsavat kapunk; op.: 94^95 C°, Ri = 0,27. 3. lépés: BOC-OSer-Tyr-Ser-Met-N2 H 3 2,2 g (10 mmól) BOC-OSer-OH-t és 4,50 g (10 mmól) H-Tyr-Ser-Met-OCH3 .HCl-ot feloldunk 15 ml dimetilformamidban. Az oldatot 0 C°-ra hűtjük és hozzáadunk 1,11 ml (10 mmól) N-metilmorfolint, majd 1,90 g (9,2 mmól) DCC-t. A reakcióelegyet 1 órán keresztül 0 C°-on keverjük, majd másnapig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután a DCU-t kiszűrjük, a szűrletet bepároljuk, a maradékot 200 ml etilacetátban oldjuk. Az oldatot kétszer 100 ml n sósawal, kétszer 100 ml 8%-os nátriumhidrogénkarbonát-oldattal kirázzuk, majd szárítás után bepároljuk. A maradékot (3,7 g védett, aminooxikarbonsavval helyettesített tetrapeptidészter) 40 ml metanolban feloldjuk, hozzáadunk 1,0 ml (20,4 mmól) hidrazin-5 hidrátot és másnapig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Másnap a metanolt ledesztilláljuk, a maradékot etilacetáttal eldörzsöljük, szűrjük, etilacetáttal, éterrel mossuk és tömény kénsav mellett szárítjuk. 2,5 g (44%) aminooxikarbonsawal helyettesített védett te-10 trapeptid hidrazidot kapunk; op.: 141 C°, 1^=0,30. Elemzés a Ca 5 H 4 0 N 6 Oi 0 S összegképlet alapján: számított: C 48,7%; H 6,55%; N 13,6%; talált:C 48,3%; H 6,7%; N 13,3%. 15 4. lépés: BOC-OSer-Tyr-Ser-Met -Glu (OBu^-His -Phe-Arg-Trp-Gly-Lys (BOO- Pro-Val-Gly-OH.HCI 20 0,274 g (0,446 mmól) BOC-OSer-Tyr -Ser-Met -N2 H 3 -ot feloldunk 3,2 ml dimetilformamidban. A -20 C°-ra hűtött oldatba keverés közben becsepegtetünk 0,41 ml (1,8 mmól) 4,4 n etilacetátos sósav-oldatot, majd 0,07 ml (0,59 mmól) terc-bűtilnitritet. A 25 reakcióelegyet 5 percig -10 C°-on keverjük, majd -20 C°-ra hűtjük és hozzáadjuk 0,600 g (0,438 mmól) H-Glu (OBut) -His-Phe-Arg-Trp -Gly-Lys (BOC)-Pro -Val-Gly-OH és 0,31 ml (1,8 mmól) düzopropil-etilamin 5 ml dimetflformamidos oldatát, j 30 A reakcióelegyet 1 órán keresztül -5 és 0 C° közötti hőmérsékleten keverjük, majd másnapig 0 C°-on állni hagyjuk. Ezután az oldatot bepároljuk és a maradékot 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal eldörzsöljük. Szűrés, vizes mosás, szárítás után 0,69 g (79%) védett, 35 aminooxikarbonsawal helyettesített tetradekapeptidet kapunk. 1 ml tömény sósav és 1 ml piridin elegyítésével piridin-hidroklorid oldatot készítünk és hozzáadjuk az 5 ml metanolban szuszpendált védett, aminooxikarbonsawal helyettesített tetradekapeptid-40 hez. Az így kapott oldatot 50 ml vízzel hígítjuk, a kivált csapadékot leszűrjük, vízzel mossuk és szárítjuk. 0,471 g (54%) védett, aminooxikarbonsawal helyettesített tetradekapeptid-hidrokloridot kapunk; op.: 198-202 C°, R| =0,16. 45 5. lépés: BOC-OSer -Tyr-Ser-Met-Glu (OBuVHís -Phe-Arg-Trp -Gly-Lys (BOC) -Pro-Val-Gly-Lys (BOC) -Lys(BOC) -Arg-Arg -Pro-50 -Val-Lys (BOC)- Val-Tyr (Bul) -Pro-Asp(OBuVAIa-Gly-Glu (ObuVOBu* 0,350 g (0,176: mmól>BOC-OSer-Tyr -Ser-Met -Glu (OBu^-His -Phe-Arg-Trp-Gly-Lys (BOC> 55 -Pro-Val- Gly-OH.HCl-ot, 0,400 g (0,176 mmól) H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg -Arg-Pro-Val-Lys(BOC)- Val-Tyr (Bu*)- Pro-Asp (OBu^-Ala -Gly-Glu (OBu^-OButj HCl-ot és 0,281 g (1,05 mmól PCPOH-t feloldunk 3,3 ml dimetilformamidban 60 és hozzáadunk 0,025 ml (0,18 mmól) trietilamint, majd 0,074 g (0,36 mmól) DCC-t. A reakcióelegyet 2 napig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd a DCU-t kiszűrjük és a szűrletet 30 ml éterrel hígítjuk. A kivált terméket leszűrjük, éterrel mossuk, szárítjuk. 65 0,659 g (88,5%) védett, aminooxikarbonsawá helyettesített oktakozapeptid-trihidrokloridot kapunk: op.: 160-166 C°,RJ =0,22. 7 <*t
