167655. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-terminálisán alfa-aminooxikarbonsavat tartalmazó, új, ACTH hatású polipeptidek előállítására
167655 9 10 0,70 g (81%) védett, aminooxikarbonsawal helyettesített tetradekapeptidet kapunk. 1 ml tömény sósav és 1 ml piridin elegyítésével piridin-hidroklorid oldatot készítünk és hozzáadjuk az 5 ml metanolban szuszpendált védett, aminooxikarbonsawal helyettesí-5 tett tetradekapeptidhez. Az így kapott oldatot 50 ml vízzel hígítjuk, a kivált csapadékot szűrjük, vízzel mossuk és szárítjuk. 0,513 g (59,5%) védett, aminooxikarbonsawal helyettesített tetradekapeptid-hidrokloridot kapunk; op.: 200-202 C°, R? = 0,19. 10 1. lépés: terc-Butiloxikarbonil- L-alfa-aminooxipropionsav (BOC-OAIa-OH) 4,0 g (29 mmól) D-alfa-brómpropionsavat, 3,62 g (65 mmól) káliumhidroxidot és 4,39 g (33 mmól) terc-butiloxikarbonil-hidroxilamint az 1. példa 1. lépés szerint reagáltatunk és dolgozunk fel. A nyers termékt feloldjuk éterben és 6,3 ml (32 mmól) diciklohexilamint adunk hozzá. így 6,7 g (60%) terc-butiloxikarbonil -L-alfa-aminooxipropionsav- diciklohexilaminsótkapunkjop.: 157 C°. A diciklohexilaminsó éteres szuszpenzióját 0,2 n kénsawal rázva, majd az éteres réteget bepárolva 3,05 g (50%) terc-butiloxikarbonil-L— alfa-aminooxipropionsavat kapunk: op.: 110-112 C°, [a]^0 = -91° (c = 1, etanol). Elemzés: a C8 H ls N0 5 összegképlet alapján: számított: C 46,4%; H 7,4%; N 6,8%; talált:C 46,6%; H 7,5%; N 6,8%. 2. lépés: BOC-OAIa-Tyr-Ser-Met-N2 H 3 1,44 g (7,0 mmól) BOC-OAla-OH-t és 3,50 g (7,8 mmól) H-Tyr-Ser-Met-OCH3 .HCl-ot feloldunk 12 ml dimetilformamidban. Az oldatot 0 C°-ra hűtjük és hozzáadunk 0,85 ml (7,8 mmól) N-metilmorfolint, majd 1,48 g (7,2 mmól) DCC-t. A reakcióelegyet 1 órán keresztül 0 C°-on keverjük, majd másnapig szobahőmérséldeten állni hagyjuk. Ezután a DCU-t kiszűrjük, a szűrletet bepároljuk és a maradékot 150 ml etilacetátban feloldjuk. Az oldatot kétszer 100 ml n sósawal, kétszer 100 ml 8%-os nátriumhidrogénkarbonátoldattal kirázzuk, és szárítás után bepároljuk. A maradékot 35 ml metanolban feloldjuk, 1,00 ml (20 mmól) hidrazinhidrátot adunk hozzá és a reakciókeveréket szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Másnap a metanolt ledesztilláljuk, a maradékot etilacetáttá eldörzsöljük, szűrjük, etilacetáttal, éterrel mossuk és tömény kénsav mellett szárítjuk. 2,1 g (50%) cím szerinti védett tetrapeptid-hidrazidot kapunk; op.: 147 C° (vízből átkristályosítva), %' =0,43. Elemzés a C2 s H4 0 N 6 0 9 S összegképlet alapján: számított: C 50,0%; H 6,7%; táált:C 49,6%; H 6,7%. 3. lépés: BOC-OAIa-Tyr-Ser -Met-Glu (OBu1 ) -His-Phe-Arg-Trp- Gly-Lys (BOC)-Pro-Val-Gly-OH.HCI 0,266 g (0,44 mmól) BOC-OAla-Tyr-Ser-Met-N2 H 3 -ot feloldunk 3,2 ml dimetilformamidban. A -20 C°-ra hűtött oldatba keverés közben becsepegtetünk 0,41 ml (1,8 mmól) 4,4 n etilacetátos sósavoldatot, majd 0,07 ml (0,59 mmól) terc-butilnitritet. A reakcióelegyet 5 percig -10 C°-on keverjük, majd -20 C°-ra hűtjük és hozzáadjuk 0,600 g (0,438 mmól) H-Glu (OBut)-His-Phe-Arg-Trp -Gly-Lys (BÖC)-Pro -Val-Gly-OH és 0,31 ml (1,8 mmól) diizopropil-etilamin 5 ml dimetilformamidos oldatát. A reakcióelegyet 1 órán keresztül -5 és 0 C° közötti hőmérsékleten keverjük, majd másnapig 0 C°-on állni hagyjuk. Ezután a dimetilformamidot ledesztilláljuk és a maradékot 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal eldörzsöljük. Szűrés, vizes mosás, szárítás után 4. lépés: BOC-OAla- Tyr-Ser-Met -Glu (OBuVHis -Phe-Arg-Trp- Gly-Lys(BOC)- Pro-Val-Gly -Lys (BOC)-Lys (BOC) -Arg- Arg-Pro-Val -Lys(BOC)-Val -Tyr (BuVPro-Asp (OBu*)Ala-Gly-Glu (OBuVOBut.a HCl 3. példa H-D-OAIa-Tyr -Ser-Met- Glu-His -Phe-, 40 -Arg-Trp -Gly-Lys-Pro- Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg -Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asp - Ala-Gly-Glu-OH 0,600 g (0,142 mmól) BOC-D-OAla -Tyr-Ser-45 -Met -GluíOBu^-His -Phe-Arg-Trp-Gly-Lys (BOC)-Pro-Val- Gly-Lys (BOC)-Lys (BOC)-Arg -Arg-Pro-Val-Lys (BOCO-Val-TyríBu1)- Pro-AspíOButj-Ala-Gly-GluíOBu^-OBut-SHCl-t felöl dunk 4,8 ml trifluorecetsav, 0,6 ml víz és 0,6 ml 50 anizol elegyében. Az oldatot 1 órán keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd 60 ml éterrel hígítjuk. A kivált csapadékot szűrjük, éterrel mossuk, foszforpentoxid és káliumhidroxid mellett vákuumban szárítjuk. 0,546 g (88,5%) aminooxikarbonsawal 55 helyettesített oktakozapeptid-trifiuoracetátot kapunk. A nyers trifluoracetátot 10 ml vízben oldjuk, a trifluoracetát ionokat acetát-ciklusú Dowex 1x8 ioncserélő gyantával acetát-ionokra cseréljük. Az így 60 kapott helyettesített oktakozapeptid-acetát- oldatot Whatman CM-52 ioncserélőből készített 4,5x62 cm-es oszlopra öntjük, majd 2 liter 0,01 mólos (pH 4,5) és 2 liter 0,4 mólos (pH 6,7) ammóniumacetát pufferból készült lineáris puffer gradienssel 80 ml/óra sebesség-65 gel eluáljuk. A kívánt anyagot tartalmazó 98-112. frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. 0,245 g (39%) aminooxikarbonsawal helyettesített okta^ 0,348 g (0,176 mmól) BOC-OAIa-Tyr -Ser-20 -Met-Glu (OBu T )-HÍs-Phe -Arg-Trp-Gly -Lys(BOC)-Pro -Val-Gly- OH.HCl-ot, 0,400 g (0,176 mmól) H-Lys(BOC)-Lys (BOC)- Arg-Arg-Pro -Val-Lys (BOC)- Val-TyríBu^-Pro- Asp oc (OBu^Ala -Gly-Glu -OBut.3HCl-ot és 0,281 g 25. (1,05 mmól) PCPOH-t feloldunk 3,3 ml dimetilformamidban és hozzáadunk 0,025 ml (0,18 mmól) trietilamint, majd 0,074 g (0,36 mmól) DCC-t. A reakcióelegyet 2 napig szobahőmérsékleten állni hagy_ juk, majd a DCU-t kiszűrjük és a szűrletet 30 ml 30 éterrel hígítjuk. A kicsapódott terméket leszűrjük, éterrel mossuk, szárítjuk. 0,658 g (89%) védett aminooxikarbonsawal helyettesített oktakozapeptidtrihidrokloridot kapunk, op.: 175-177 C°, R| = 0,25.
