167655. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-terminálisán alfa-aminooxikarbonsavat tartalmazó, új, ACTH hatású polipeptidek előállítására

7 167655 . 8 terméket (419 g) kloroform-n- hexán elegyéből kristályosítjuk. Termelés: 388,8 g (86%) terc-butiloxikarbonil-aminooxiecetsav: op. 115—116 C*. Elemzés a C7

H

13

NO

s

összegképlet alapján: számított: C 49,1%; H 6,5%; N 14,4%; talált,« 49,0%; H 6,6%; N 14,4%. 2. lépés: BOC-OGly-Tyr-Ser-Met-Nj H3 1,72 g (9,0 mmól) BOC-OGly-OH-t és 4,50 g (10 mmól) H-Tyr-Ser-Met-OCH3

.HCl-ot [1 212 981 számú NSzK-beli szabadalmi leírási feloldunk 10 ml dimetüformamidban. Az oldatot 0 C -ra hűtjük és hozzáadunk 1,11 ml (10 mmól) N-metÜ-morfolint, majd 1,85 g (9,0 mmól) DCC-t. A reakcióelegyet 1 órán keresztül 0 C°-on keverjük, majd másnapig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután a DCU-t kiszűrjük, a szűrletet bepároljuk és a maradékot 200 ml etüacetátban feloldjuk. Az oldatot kétszer 100 ml n sósavval, kétszer 100 ml 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal kirázzuk, és szárítás után bepároljuk. A kapott 4,5 g nyers helyettesített védett tetrapeptid metilésztert feloldjuk 45 ml metanolban, 1,26 ml (26,0 mmól) hidrazinhidrátot adunk hozzá és a reakcióelegyet másnapig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután az oldatot bepároljuk, a maradékot etilacetáttal eldörzsöljük, szűrjük, etilacetáttal, éterrel mossuk és tömény kénsav mellett szárítjuk. 3,30 g (62,5%) aminooxikarbonsawal helyettesített védett tetrapeptid-hidrazidot kapunk; op.: 137 C° (vízből átkristályosítva), Rj- = 0,36. Elemzés a C24H38

N

6

0

9

S összegképlet alapján: számított: C 49,1%; H 6,5%; N 14,4%; talált;C 49,0%; H 6,6%; N 14,4%. 3. lépés: BOC-OGly-Tyr-Ser-Met-GMOBu^-His-Phe- Arg-Trp- Gly-Lys(BOC) -Pro-Val- Gly-OH.HCI 0,41 g (0,70 mmól) BOC-OGly-Tyr-Ser-Met—Na

H

3

—ot feloldunk 5 ml dimetüformamidban. A -20 C°-ra hűtött oldatba keverés közben becsepegtetünk 0,64 ml (2,8 mmól) 4,4 n etilacetátos sósavoldatot, majd 0,105 ml (0,85 mmól) terc-butilnitritet. A reakcióelegyet 5 percig -10 C°-on keverjük, majd -20 C°-ra hűtjük és hozzáadjuk 0,96 g (0,70 mmól) H-GluODBu1)- His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys (BOC) -Pro -Val-Gly -OH [155 880 számú magyar szabadalmi leírás] és 0,48 ml (2,8 mmól) diizopropil-etilamin 8 ml dimetil-formamidos oldatát. A reakcióelegyet 1 órán keresztül -5 és 0 C° közötti hőmérsékleten keverjük, majd másnapig 0 C°-on állni hagyjuk. Ezután az oldatot bepároljuk és a maradékot 8%-os nátriumhidrogénkarbonátoldattal eldörzsöljük. Szűrés, vizes mosás és szárítás után 0,93 g (69 %) aminooxikarbonsawal helyettesített, védett tetradekapeptidet kapunk. Ezt 6 ml metanolban szuszpendáljuk és hozzáadunk 1,35 ml piridin és 1,35 ml tömény sósav elegyítésével nyert piridin-hidroklorid oldatot. Az így kapott oldatot 50 ml vízzel hígítjuk, a kicsapódott védett aminooxikarbonsawal helyettesített tetradekapeptid- hidrokloridot szűrjük, vízzel mossuk és szárítjuk. Kitermelés: 0,78 g (57%); op.: 202-204 C°,R| = 0,18. 4. lépés: BOC-OGly-Tyr-Ser-Met -Glu (OBu*) -His-Phe-Arg-Trp -Gly-Lys(BOC)- Pro-Val-Gly -Lys(BOC)-Lys (BOC) -Arg-Arg-Pro- Val-Lys (BOO-Val-TyrlBu^-Pro- Asp (OBu*)-5 Ala-Gly-GMOBu^Obu^HCI 0,345 g (0,176 mmól) BOC-OGly -Tyr-Ser-Met-Glu (OBut)-His -Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC) -Pro-Val- Gly-OH.HCl-ot, 0,400 g 10 (0,176 mmól) H-Lys(BOC)-Lys (BOQ-Arg-Arg-Pro-Val-Lys (BOC)-Val-Tyr (Bu^-Pro-Asp (OBu^-Ala-Gly-Glu (OBu^OBu^HCl-ot [155 880 számú magyar szabadalmi leírás] és 0,281 g (1,05 mmól) PCPOH-t feloldunk 3,3 ml dimetilfor-15 mamidban és hozzáadunk

0,025 ml (0,18 mmól) trietilamint, majd 0,074 g (0,36 mmól) DCC-t. A reakcióelegyet 2 napig szobahőmérsékleten állni hagyjuk majd a DCU-t kiszűrjük és a szűrletet 30 ml éterrrel hígítjuk. A kicsapódott terméket szűrjük, 20 éterrel mossuk, szárítjuk.

0,640 g (87%) védett aminooxikarbonsawal helyettesített oktakozapeptid-trihidrokloridot kapunk; op.: 208-212 C°, %3

= 0,22. 2. példa H-OAla- Tyr-Ser-Met-Glu -His-Phe -Arg~. -Trp -Gly-Lys-Pro-Val- Gly-Lys-Lys-Arg-JU -Arg -Pro-Val-Lys-Val- Tyr-Pro- Asp-Ala-Gly-Glu-OH 0,600 g (0,142 mmól) BOC -OAla- Tyr -Seroc -Met-Glu (OBut> His-Phe-Arg -Trp-Gly-Lys 35 (BOC)-Pro- Val-Gly-Lys(BOC) -Lys(BOC)-Arg -Arg-Pro-Val-Lys (BOC)-Val-Tyr (Bu^-Pro-Asp (OBu^Ala -Gly-Glu (OBu^-OBu*^ HCl-ot feloldunk 4,8 ml trifluorecetsav, 0,6 ml víz, és 0,6 ml -Q anizol elegyében. Az oldatot 1 órán keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd 60 ml éterrel hígítjuk. A kivált csapadékot szűrjük, éterrel mossuk, foszforpentoxid és káliumhidroxid mellett vákuumban szárítjuk. 0,532 g (86,5%) aminooxikarbonsawal 45 helyettesített oktakozapeptid-trifluoracetátot kapunk. A nyers triíluorace tatot 10 ml vízben oldjuk, a trifluoracetát ionokat acetát ciklusú Dowex 1x8 ioncserélő gyantával acetát ionokra cseréljük. A kapott helyettesített oktakozapeptidacetát oldatot 50 Whatman CM-52 ioncserélőből készített 4,5x59 cm-es oszlopra öntjük, majd 2 liter 0,01 mólos (pH 4,5) és 2 liter 0,4 mólos (pH 6,7) ammóniumacetát pufferből készült lineáris puffergradiensseí 80 ml/óra __ sebességgel eluáljuk. A kívánt anyagot tartalmazó 101-113 frakciókat összegyűjtjük és liofüizáljuk. 0,23 g (42%) aminooxikarbonsawal helyettesített oktakozapeptidet kapunk; pepiid tartalom: 85,1% (UV elnyelés alapján), Met-szulfoxid tartalom: 2,7%, Rn Tyr/Trp arány: 2,10, aminosavanalízis: Lys 3,89 (4), DU His 0,97 (1), Arg 3,00 (3), Asp 1,10 (1), Ser 0,97 (1), Glu 1,94 (2), Pro 3,10 (3), Gly 3,06 (3), Ala 1,15 (1), Val 2,84 (3), Met 0,68 (1), Tyr 1,94 (2), Phe 1,06 0).Rf = 0,30. 65 A kiinduló anyagként használt védett, aminooxikarbonsawal helyettesített oktakozapeptid-trihidrokloridot az alábbi módszerrel készítjük;