167655. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-terminálisán alfa-aminooxikarbonsavat tartalmazó, új, ACTH hatású polipeptidek előállítására
5 167655 6 módszerekkel szabadíthatók fel. A szabad bázisok viszont savakkal reagáltatva gyógyászati célokra alkalmazható addíciós sókká alakíthatók. E célra használhatunk szervetlen savakat, mint sósav, kénsav és foszforsavak és szerves savakat is, mint hangyasav, ecetsav, hosszabb szénláncú zsírsavak, tejsav, borkősav, citromsav, stb. A találmány szerinti eljárással készült peptidek a szokásos gyógyszerkészítmények formájában kerülhetnek gyógyászati felhasználásra. Az ilyen gyógyszerkészítmények a találmány szerinti vegyületeket enterális vagy parenterals beadásra alkalmas szerves vagy szervetlen vivőanyag kíséretében tartalmazzák, így a gyógyszerkészítmények lehetnek szilárd liofilizátumok, mikoris vivőanyagként peptidekkel nem reagáló vegyületek például mannit, tejcukor, keményítő jöhetnek számításba, lehetnek szuszpenziók és emulziók, melyek különböző semleges tartósító, stabilizáló segédanyagokat is tartalmaznak. Különösen előnyös, ha a gyógyszerkészítmény a találmány szerinti vegyületeket komplexek formájában tartalmazza, melyek a készítménynek elhúzódó hatást biztosítanak. Gyógyászatilag felhasználható komplexek alatt a találmány szerinti eljárással készült peptidek oly vegyületei értendők, amelyek bizonyos szerves és szervetlen anyagok hozzáadására keletkeznek és a peptideknek elhúzódó hatást biztosítanak. Ilyen szerves vegyületek lehetnek például bizonyos zselatinok, karboximetil-cellulózok, alginsav észterek, polifloretinfoszfát, aminosav polimerek vagy egyéb polimerek és kopolimerek. A szervetlen vegyületek közül bizonyos fémek, elsősorban a cink hidroxidja, és nehezen oldható sói, mint foszfátjai vagy pirofoszfátjai jöhetnek számításba. A fenti hatás elérésére alkalmasak bizonyos szilikátok is, melyekkel a peptidek Ugyancsak oldhatatlan - nem tisztázott szerkezetű - komplexeket képeznek. A gyógyszerkészítmények a találmány szerinti vegyületeket az adrenokortikotróp hormon szokásos dózisának megfelelően például 0,5-5 mg/ml koncentrációban tartalmazzák. Ezeket szubkután, intramuszkulárisan vagy parenterálisan adagolhatjuk hetente 1-7 szer. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik. A példákban az aminosav és peptidszármazékok jelölésére használt rövidítések az ltJPAC-IÜB által ajánlottak [JBioLChem. 2£Z 977(1972) ]. Azalfa-aminooxisavak jelölésére, az aminosav rövidítésekhez hasonlóan használjuk a fentebb már említett OGly, ÖAla, OSer szimbólumokat. A fenti rövidítések a Gly és OGly kivételével, ha csak nincs külön jelölve', az L-antipódokra vonatkoznak. Egyéb rövidítések: PCPOH = pentaklórfenol, PFPOH = pentafluorfenol, DC€ = diciklohexil-karbodiimid, DCU = diciklohexü-karbamid, BOC = terc-butiloxikarbonil, Bul = terc-butil, QNSu = N-szukcinimidoxi, Z = karbobenzoxi. Az olvadáspontmeghatározások dr. Tottoli-féle készülékben (Büchi, Schweiz) történtek. A vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatokat kovasavgél (Silicagel nach Stahl) adszorbensen végeztük az alábbi oldószerelegyekben: 1. etilacetát: (piridin:ecetsav: víz = 20:6:11) = 8:2 2. etilacetát: (piridin:ecetsav:víz = 20:6:11) = 6:4 3. etilacetát: piridin:hangyasav:víz = 50:20:6:5,5 4. kloroform: metanol = 98:2 5. kloroform: metanol = 95:5 6. n-butanol: piridin:ecetsav:víz = 30:20:6:24 7. kloroform: n-hexán:ecetsav = 8:1:1 8. etilacetát: (piridin:ecetsav:víz = 20:6:11) = 9:1 A peptidek ioncserélő kromatográfiás tisztításánál 5 az eluátumot UVICORD III (LKB, Svédország) átfolyóküvettás ultraibolya extinkcióméteren átvezetve folyamatosan regisztráltuk az eluátum fényelnyelését 280 nm-en. Az eluátumot 25 ml-es frakciókban gyűjtöttük, és a terméket az elnyelési görbe alapján 10 határoztuk meg. 1. példa 15 H-OGly- Tyr-Ser-Met-Glu -His-Phe-Arg-Trp-Gly -tys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys -Arg-Arg-Pro -Val-Lys-Val- Tyr-Pro- Asp-Ala-Gly-Glu-OH 20 0,600 g (0,143 mmól) BOC-OGly-Tyr-Ser-Met -Glu (OBuVfíis -Phe-Arg-Trp- Gly-Lys(BOC> -Pro- Val-Gly-Lys (BÖC)-Lys (BOC)-Arg-Arg-Pfo-Val-Lys (BOC)-Val -Tyr (But)-Pro-Asp (OBu^-Ala- Gly-Glu (OBu^-GBut.S HCl-t felol-25 dunk 4,8 ml trifluorecetsav, 0,6 ml víz és 0,6 ml anizol elegyében. Az oldatot 1 órán keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd 60 ml éterrel meghígítjuk. A kivált csapadékot szűrjük, éterrel mossuk, foszforpentoxid és káliumhidroxid mellett 30 vákuumban szárítjuk. 0,538 g (87%) helyettesített oktakozapeptid trifluoracetátot kapunk. A nyers trifluoracetátot 10 ml vízben oldjuk és a trifluoracetát ionokat acetát-ciklusú Dowex 1x8 ioncserélő gyanta segítségével acetát ionokra cseréljük. A 35 kapott helyettesített oktakozapeptid acetát oldatot Whatman CM—52 ioncserélőből készített 4,5x60 cm-es oszlopra öntjük, majd 2 liter 0,01 mólos (pH 4,5) és 2 liter 0,4 mólos (pH 6,7) ammóniumacetát pufferból készített lineáris puffer gradienssel 80 40 ml/óra sebességgel eluáljuk. A kívánt anyagot tartalmazó 25-25 ml 96-106. frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. 0,22 g (34%) aminooxikarbonsawal helyettesített oktakozapeptidetkapunk;peptid tartalom: 72,3% (UV elnyelés alapján), Met-sziílfoxid tartalom: 45 1,3%, Tyr/Trp arány: 2,05, aminosavanalízis: Lys 4,05 (4), His 0,93 (1), Arg 3,08 (3), Asp 0,99 (1), Ser 0,79 (1), Glu 2,01 (2), Pro 3,09 (3), Gly 3,04 (3), Ala 0,92 (1). Val 3.12 (3). Met 0,60 (1), Tyr 1,88 (2), Phe 0,85 (l).Rf*= 0,25. 50 A kiinduló anyagként használt védett, aminooxikarbonsawal helyettesített oktakozapeptid trihidrokloridot az alábbi módszerrel készítjük. 55 1. lépés: terc-Butiloxikarbonil-am inooxiécetsav (BOC—Ogly-OH) 60 316,0 g (2,37 mól) terc-butüoxikarbonil- hidroxilamint 2680 ml etanolban oldunk, majd hűtés közben hozzáadunk 207,8 g (5,19 mól) nátriumhidroxidot és 350,4 g (2,52 mól) monobrómecetsavat. A reakcióelegyet 20 percig forraljuk, majd az oldószert ledesz-65 tilláljuk. A maradékot 1940 ml vízben feloldjuk és tömény sósavval pH 3-ra savanyítjuk., A kivált kristályokat két órai hűtés és keverés után szűrjük. A nyers 3
