167655. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-terminálisán alfa-aminooxikarbonsavat tartalmazó, új, ACTH hatású polipeptidek előállítására
3 167655 B -Lys- vagy -Arg-csoportot, C -Gly-, Lys-, -D-Lys- vagy -Pro- csoportot és D -OH csoportot vagy -Val-Lys-Val-Tyr-Pro-E-F-G-Glu-K általános képletű csoportot jelent, és az utóbbi képletben E -Asp- vagy -Asn-, F -Gly-vagy-Ala-, G -Gly-vagy-Ala-, és K -OH vagy -Asp-Glu-Ser-Ala-OH csoportot képvisel-, valamint savaddiciós sóik és amidjuk előállítására. A találmány szerint az (I) általános képletű polipeptideket, savaddiciós sóikat és amidjukat úgy állítjuk elő, hogy a megfelelő, legalább a terminális aminooxi-csoportján, valamint az oldallánc aminocsoportjain, adott esetben a terminális és az oldallánc karboxilcsoportjain védett peptidról a védőcsoportokat lehasítjuk, és kívánt esetben a kapott vegyületet savaddiciós sóvá vagy amidjává átalakítjuk. Adrenokortikotróp hatásuk szempontjából a találmány szerinti vegyületek közül különösen kiemeljük az L- és D-OSer" Asp 25, Ala 26 , Gly27 -alfai-rt ACTH-t és a D-OSer1 -alfa^-3 2 -ACTH-t [ahol az OSer rövidítés alfa-aminooxi-béta- hidroxipropionsavat jelenti. A későbbiekben hasonló módon jelöljük az aminosavakkal analóg szerkezetű alfa-aminooxisavakat; így OGly = aminooxiecetsav, OAla = alfa-aminooxipropionsav; az alfa.-ACTH rövidítés az újabban helyesbített szerkezetű emberi ACTH-ra vonatkozik [B.Riniker, P. Sieber, W. Rittel, H. Zuber: Nature ' New Biology 235* J 14 (1972); L. Gráf, S. Bajusz, A. Patthy, E. Barát, G.Cseh: Acta Biochim. Biophys. Acad, Sei. Hung. 6*_ 415 (1971)]. A kiindulási anyagként használt védett peptideket egy védett alfa-aminooxisavból kiindulva önmagában ismert módon, fragmenskondenzációval vagy aminosavankénti lánchosszabbítással állítjuk elő, amikor a vegyesanhidrides, azidos, aktívészteres és DCC-s technikát használhatjuk, de alkalmazhatjuk az úgynevezett szilárdfázisú szintézist is, amelynél a láncvégi karboxilcsoportjával valamely polimerrel összekapcsolt pepiidet úgy építünk fel, hogy az aminosavakat, végül pedig az alfa-aminooxisavat a polimerhez kötött C-terminális aminosavhoz megfelelő sorrendben hozzákapcsoljuk. A reakcióban részt nem vevő funkciós csoportokat célszerűen védjük, különösen hidrolízis, acidolízis, hidrazinolízis vagy redukció útján könnyen lehasítható csoportokkal. A karboxiícsoportot előnyösen például metanollal, terc-butanoUal,benzüalkohollal, •- p-klórbenzilalkohollal észterezve vagy amidképzésseí védhetjük, az aminooxi- és amjnocsoportok védelmé-<fe pedig elsősorban a tozil-, tritil-, formil-, trifluoracetil-, o-nitro- szulfenil-, ftalil-, benziloxikarbonil-, p-klórbenziloxikarbonil-, különösen pedig a terc-butiloxi-karbonil-csoportot használjuk. Az arginin guanidino-csoportjának védésére mindenekelőtt a nitrocsoport alkalmas, de protonált formájában is tudjuk alkalmazni. A hisztidin iminocsoportja benzil-, tritil-, vagy dinitrofenil- csoporttal védhető. Az oldalláncok hidroxilcsoportjait esetenként éter formájában védjük, amikor előnyösen alkalmazhatók.a terc-butanollal és a benzilalkohollal képzett éterek. A védőcsoportok megfelelő kombinációjával eltudjuk érni, hogy ezek önmagukban ismert módszerek szerint például hidrolízissel, acidolízissel, hidrazinolízissel vagy redukcióval szelektíven, illetve egyszerre eltávolíthatók legyenek. 5 Az eljárás egy előnyös kiviteli módja értelmében úgy járhatunk el, hogy az l-es helyzetű védett alfa-aminooxisavat a H-Tyr-Ser-Met-OCH3 tripeptid metilészterrel kondenzáljuk és a kapott peptid metilészterből képzett hidrazidot aziddá alakítva meg-10 acilezzük a H-GluíOBu*)- His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC>Pro-Val- Gly-OH dekapeptidet. Az így kapott helyettesített tetradekapeptidet azután a megfelelően védett C-terminális szekvenciával kondenzáljuk. I gy például helyettesített hexadekapeptid előállí-15 tása esetén a 15-16-os dipeptiddel, helyettesített oktadekapeptid előállításaesetén a 15-18-as tetrapeptiddel, helyettesített oktakozapeptid előállítása esetén a 15—28-as tetradekapeptiddel, helyettesített dotriakontapeptid előállítása esetén a 15-32-esokta-20 dekapeptiddel, helyettesített nonatriakontapeptid előállítása esetén 15—39-es tetrakozapeptiddel kondenzáljuk. Ilyen kondenzációnál kapcsolási módszerként előnyösen használható a DCC-s vagy az aktívészteres módszer. Az utóbbi esetben, különösen 25 pentaklórfenil- vagy pentafluorfenil-észter alkalmazásánál az aktív észtert nem szükséges elkülönítenünk, hanem a kondenzációs reakcióelegyben képezhetjük a helyettesített tetradekapeptidből pentaklórfenol vagy pentafluorfenol és DCC segítségével [155 880 számú 30 magyar szabadalmi leírás és L. Kisfaludy és munkatársai Chemistry and Biology of Peptides, Ann Arbor Science Publ., New York 1972, 299 old.] A kiinduló anyagként szolgáló védett, az l-es helyzetben mindig alfa-aminooxisavat tartalmazó pep-35 tidek felépítésének egy alternatív lehetősége az, hogy a megfelelő C-terminális szekvenciát a védett 5—14 dekapeptiddel acilezzük, majd a kapott peptid N-terminális védőcsoportját eltávolítva utolsó lépésként az 1-4 helyettesített tetrapeptiddel acilezzük. Ezen a 40 módon az N-terminális tetrapeptidszármazékból közvetlenül jutunk a kiindulási anyagként használt N-terminálisán alfa-aminooxisavat tartalmazó védett pepiidhez. A szintézis végén az N-terminális alfa-aminooxi-45 -csoporton és az oldalláncok aminocsoportjain lévő terc-butiloxikarbonil-csoportot, az oldalláncok karboxilcsoportján, *és a C-terminális karboxilcsoporton lévő terc-butilészter-csoportot és az oldallánc hidroxilcsoportjain esetleg jelenlévő terc-butilésztercsoportot egyidejűleg acidolízissel, előnyösen trifluorecetsavas kezeléssel hasítjuk le. A védőcsoportjaitól megszabadított végtermék tisztítása történhét ellenáramú megosztással vagy oszlopkromatográfiás gg módszerrel például különböző karboximetilcellulóz-féleségeken végzett ioncserélő kromatográfiával. A példákban leírt új vegyületek Sayers tesztben [M.A.Sayers, G.Sayers és L.A.Woodbury, Endocrinology 42, 329 (1948); G. Hamburger, Acta Endoc, 60 ""i-^Sj 594 (I960)] mért biológiai aktivitása esetenként felülmúlja a megfelelő, alfa-aminooxisawal nem helyettesített ACTH fragmensek biológiai hatását, például a [D-OSer1 ] -alfa h 1 -32 -ACTH aktivitása fenti vizsgák tok szerint 127 NE/mg-nak bizonyult. c 65 Az új vegyületeket az előállítás során alkalmazott módszertől függően szabad bázisok vagy sók formájában kapjuk. A sókból a bázisok önmagukban ismert
