167528. lajstromszámú szabadalom • Eljárás G-418, verdamicin I, sziszomicin és gentamicin A antibiotikumokat tartalmazó keverék és alkotórészei előállítására

167528 31 32 1,0 liter fenti összetételű táptalaj pH-ját 7,3-ra állítjuk be, és 0,5 literes alikvot mennyiségeket 2 literes Erlenmeyer-lombikokba töltünk. A táptalajt 121 C°-on 45 percig sterilizáljuk, majd szobahőmérsékletre hűtjük, és mindegyik lombikot be- 5 oltjuk 5 ml Micromonospora grisea tenyészettel. A lombikot 72 óra hosszat forgó rázógépen (200 fordulat/perc) 30 C°-on inkubáljuk. Mindegyik 0,5 liter steril C táptalajt tartalmazó lombikhoz 25 ml ilyen oltóanyagot adunk, és forgó rázógépen 30 C°-on 10 48 óra hosszat inkubáljuk. 5 liter ilyen oltóanyagot egyesítünk, 90 liter steril C táptalajhoz adjuk, és a hőmőrsékletet 30 C°-ia, a pH-t 7,3-7,7-re, a levegőztetést percenkint 28-56 literre és a keverést percenkint 200-400 fordulatra állítjuk be. A 15 fermentálást 100-130 óra hosszat, a maximális antibiotikus hatékonyság eléréséig folytatjuk, azután a fermentlevet a 4. példa szerint feldolgozzuk. 20 4. példa Az antibiotikum keverék elkülönítése Az 1-3. példák szerint előállított 60 liter fer- 25 mentléhez erőteljes keverés közben 400 g oxálsavat adunk, 6 n kénsav hozzáadásával a pH-t 2,0-ra állítjuk be, és a keverést még 20 percig folytatjuk. A megsavanyított fermentlét szűrjük, és a szüredéket megtartjuk. A micéliumból álló szűrőlepényt 30 csapvízzel mossuk, és a mosófolyadékot a leszűrt fermentlével egyesítjük. Előnyös, ha háromszor 60 liter (vagyis összesen 180 liter) fermentléből kapott szüredéket és mosófolyadékot egyesítünk. A folyadékot 6 n ammóniumhidroxiddal közöm- 35 bösítjük (500—900 ml-re van szükség). Az antibiotikum keveréket ammóniumfázisú Amberlite [RC-50 ioncserélővel adszorbeáltatjuk azáltal, hogy a semleges fermentlét 5,1 cm átmérőjű és 65,6 cm magas oszlopon folyatjuk át. A fermentlé átfolyása 40 közben az áramlás sebessége percenkint 175-200 ml. Az oszlopot 20 liter ionmentesített vízzel színtelenre mossuk. Az antibiotikum keveréket percenkint 80 ml sebességgel áramoltatott 2 n ammóniumhidroxiddal eluáljuk, majd amikor az 45 eluátum pH-ja elérte a 10-et, ionmentesített vízzel mossuk. Az eluátumot vákuumban 1 literre bepároljuk, és az antibiotikum keverék kinyerésére liofilizáljuk. Amikor az eluátum erősen színezett, Amberlite 50 IRA 401S-sel kezelhetjük. Ezt a kezelést rendszerint úgy hajtjuk végre, hogy az első oszlopból távozó eluátumot 120 ml/perc sebességgel átfolyatjuk egy 2,51 x 50,8 cm méretű Amberlite IRA 401S oszlopon. Az Amberlite IRA-401S oszlopot a SS fent leírt módon antibiotikummentesre mossuk, és az eluátumot és a mosófolyadékot bepároljuk. 5. példa 60 a) Az antibiotikum keverék szulfátjának előállítása A 4. példa szerint kapott 37 g nyers bázis keveréket 1000 ml vízben oldjuk, és a pH-t 65 kénsawal 4,5-re állítjuk be. Az oldatot aktív szénnel félóra hosszat keverjük, majd leszűrjük. A szüredéket 100 ml-re bepároljuk, és fölös metanolhoz adjuk hozzá, A keletkezett vegyes szulfát csapadékot szűrőn elválasztjuk, és vákuumban szárítjuk. b) A szulfát átalakítása antibiotikum-keverék bázissá Az a) lépésben kapott szulfátokat 1000 ml kloroformban szuszpendáljuk, és a szuszpenzión fél óra hosszat ammóniagázt buborékoltatunk át. A keveréket leszűrjük, és a szüredéket bepárolva az antibiotikum keveréket bázis alakban kapjuk. 6. példa A verdamicin I, sziszomicin, G-418 és gentamicin A elkülönítése Izopropanol, kloroform és tömény vizes ammóniaoldat 1:2:1 térfogatarányú keveréke alsó fázisában 5,45 kg kovasavgélt szuszpendálunk. A szuszpenziót 10,2 cm belső átmérőjű kromatografáló oszlopra töltjük. A kromatografáló oszlop előkészítésére használt oldószerrendszer alsó fázisának 1,0 literében 100 g 4. példa szerint kapott antibiotikum keveréket szuszpendálunk. Az így kapott szuszpenziót szűrőn elválasztjuk, és az oldhatatlan anyagot a további feldolgozásra félretesszük. A szüredéket az oszlop tetejére való felöntése előtt 1,0 literre bepároljuk. A szűrőn maradt 66 g oldhatatlan anyagot melegítés és keverés közben metanolban oldjuk, és a jelenlevő 6g szervetlen anyagot szűréssel eltávolítjuk. A metanolos oldatot levegőn állni hagyva lehűtjük, majd a csak kevéssé oldható gentamicin A-karbonátot szűrőn elválasztjuk. A gentamicin A legnagyobb részétől mentesített antibiotikum keveréket a fent leírt módon elkészített kovasavgél oszloppal adszorbeáltatjuk, és a kromatogramot az oldószer keverékkel kifejlesztjük, 2,0 liter frakciót szedve az oszlop teljes áramlásánál. Amikor a sziszomicin deszorbeálódott (ez rendszerint a 90-100. frakciónál következik be), az oldószerek arányát 1 :1 : l-re változtatjuk, és az eluálást a többi anyag deszorbeálásáig folytatjuk. Az antibiotikum keveréknek ilyen méretű oszlopon történő szétválasztására általában 250-350 frakció szedése szükséges. Mindegyik frakcióból egy cseppet szűrőpapírra cseppentünk, és ninhidrin próbával állapítjuk meg az antibiotikum, vagyis a ninhidrinre pozitív anyag jelenlétét. Az antibiotikumot tartalmazó frakciókat kloroform, metanol és 17%-os ammóniumhidroxid 2:1:1 térfogatarányú keverékével papírkromatografáljuk, majd Staphylococcus aureus ATCC 6538P-vel szemben bioautografáljuk, hogy meghatározzuk, mely frakciók tartalmazzák ugyanazt az antibiotikumot. A kromatográfiás és bioautográfiás meghatározás szerint egyesítjük a frakciókat, majd az egyesített frakciókat vákuumban 100 ml-re bepároljuk, és liofilizáljuk. 16