167432. lajstromszámú szabadalom • Eljárás orgoteinben dús fehérje koncentrátum előállítására vörös vérsejtekből
167432 11 12 len volt orgotein 80%-át, és az eredetileg jelen volt hemoglobin körülbelül 1%-át tartalmazza. Amennyiben a hőkezelést a fenti körülmények között 4, illetve 5 órán át végezzük, a kapott felülúszó az eredetileg jelen volt hemoglobin körülbelül 2,5%o-ét, illetve <l%o-ét tartalmazza. A fenti kísérletek során kapott felülúszókból az orgotént ismert módszerekkel, például dialízissel és liofilizálással, acetonnal végzett frakcionált kicsapással, vagy ultraszűréssel különíthetjük el. Az így kapott szilárd anyag 60—95% argoteint tartalmaz. Sephadex G—75 gélen végzett gélszűréssel gyógyászati célokra alkalmas minőségű orgoteint állíthatunk elő. i 8. példa A 2. példában leírt eljárást követjük, azonban marha-, ember-, csirke-, juh-, illetve sertés-vörös vérsejtekből indulunk ki, és a fehérje-szenynyezéseket az acetonos kicsapás helyett enzimes kezeléssel távolíthatjuk el. A hőkezelt elegy centrifugálásakar Ikapott felülúszóhoz a kiindulási koncentrált vörös vérsejtekre számítva ml-enként 1—3 mg, négyszeres NF-aktivitású pankreatint adunk (a Pankreatin mennyisége e határokon belül az eredményeket nem módosítja), és az elegyet 37 C°-on 15—48 órára inkubáljuk. Az orgoteint kivéve lényegében minden fehérje kicsiny, dializálható fragmensekké emésztődik. Ultraszűréssel lényegében tiszta orgotein izolálható az emésztett elegyből. 9. példa Az 1. példában leírt eljárást követjük, kiindulási anyagként azonban koaguláció ellen nátriumcitráttal stabilizált teljes vért használunk. Két térfogat frissen gyűjtött marha vért (85 mg/ml össeies fehérje, 20 /<g/ml orgotein), egy térfogat 3,8%-os standard vizes trinátriumcitrát oldattal, két térfogat, 24 /^g/ml Cu2 +-t és 25 /jg/ml Zn2 +-t tartalmazó vízzel keverünk, így olyan teljes vér oldatot nyerünk, amely 100 ml-ként 1000 jug Cu2+ és Zn 2 + iont tartalmaz. 75 C°-ra melegítjük és ezen a hőmérsékleten tartjuk két óra hosszat. 1,5 térfogatrész jeges víz hozzáadásával körülbelül 10 C°-ra hűtjük le. Ez a hígítás a centrifugálás utáni külön mosást is szükségtelenné teszi. Centrifugáljuk és elválasztjuk a felülúszót (2,34 térfogatrész). A felülúszó összesen 1,5 mg/ml fehérjét és összesen 12—17 /tg/ml orgoteint tartalmaz, ami legalább 40-szeres tisztítást és 70%-os orgotein visszanyerést jelent a kiindulási vérből. Ez összhangban van a 90%-os orgotein visszanyeréssel és a legalább 50-szeres tisztítással, amikor teljes vér helyett, mosatlan vörös vérsejtekből (90 mg/ml összes fehérje) indulunk ki. A felülúszóból lényegében tiszta orgoteint izolálunk liofilizálással, ahogyan azt az 1. példában leírtuk, vagy gélszűréssel illetve DEAÉ-cellulóz kromatográfiával, ahogyan azt a 2. példában leírtuk. Az orgoteinnek a fent leírt izolálás előtti további tisztítása céljából 59 ml, 12—17 /ig/ml orgoteint tartalmazó, a hőkezelésből kapott felülúszóhoz, 50—150 mg négyszeres NF-aktivitású pankreatint és 0,1% nátriumazidot (baktériumok növekedésének meggátlására) adunk, és 37 C°on tartjuk 15 óra hosszat, majd lehűtjük. Az oldat 1 mg/ml összes fehérjét és 12 /^g/ml orgoteint tartalmaz. A Pankreatin mennyiség a közölt határokon belül nem változtatja az eredményeket. A fenti eljárásoknál a megoldás egyszerű végrehajtását tartottuk szem előtt még a felülúszóból izolált orgotein tisztaságának rovására is. Az acetonos kicsapás tisztább orgoteint biztosít, de hátránya, hogy szerves oldószer használatára van szükség. DEAE-cellulóz ioncserélő oszlop kromatográfiával, nagy tisztaságú orgotein nyerhető, ennek a módszernek azonban az a hátránya, hogy az ionerősség megfelelően alacsony szintre hozása céljából egy dialízist és egy nagy térfogatú folyadék kromatografálást kell beiktatni. Az utóbbi hátrány azonban kiküszöbölhető, ha a felülúszót vagy liofilizálással, vagy egy részének az alacsony hőmérsékleten történő ledesztillálásával előzetesen koncentráljuk. A felülúszónak ioncserélő gyantával történő keverésével megvalósított szatoaszos adszorpció ugyan kényelmesebb, mint az oszlop kromatográfia, de kevésbé hatékony. A liofilizálás, hacsak előzetes dialízis nem előzi meg, önmagában nem biztosít semmi tisztítást, nagyon kényelmes módszer azonban az orgoteinnek nagy térfogatú felülúszóból való izolálására. 10. példa 2 liter marha-vörös vérsejtet 1 milliomodrész rézszulfátot és 1 milliomodrész cinkacetátot tartalmazó 6 liter vízben hemolizálunk. A kapott elegyet, amelynek pH-ja 7,3, 2 órán át 75 C°-on hőkezeljük, majd a szuszpenzióhoz 6 liter jeges vizet adunk, és a szilárd anyagot centrifugálással elkülönítjük. A felülúszó az eredeti hemoglobin-mennyiség kb. l%o-ét és az eredeti orgotein-mennyiség több, mint 80'%-át tartalmazza. A felülúszóhoz acetont adunk (4 liter felülúszóhoz 6 liter acetont használunk fel), majd a csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, és 90 ml vízzel extraháljuk. Körülbelül 60 mg fehérjét kapunk, amely 80%-nál nagyobb mennyiségben tartalmaz orgoteint. 11. példa A 10. példában leírt eljárást követjük, azonban emberi A-típusú vörös vérsejtekből indulunk ki, és az elegy pH-ját 2 n vizes nátriumhidroxid-oldattal állítjuk be a kívánt 7,3-as értékre. Az elegyet 6 órán át 67 C°-on hőkezeljük. A centrifugálás után kapott felülúszó az eredetileg jelen volt hemoglobin 0,3—2%o-ét és az eredetileg jelen volt orgotein 40—50%-át tartalmazza. Az orgoteint a 10. példában leírt módon különítjük el. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
