167432. lajstromszámú szabadalom • Eljárás orgoteinben dús fehérje koncentrátum előállítására vörös vérsejtekből
167432 13 14 A nyers orgotein tisztítása A fenti példák bármelyike szerinti eljárással kapott nyers orgoteint gélszűréssel tisztíthatjuk. Sephadex G—75 (Superfine) géllel töltött oszlopra (3,2X88,5 cm; teljes ágytérfogat: 711,5 ml; üres térfogat: 265,5 ml) 2—5 g nyers orgoteint viszünk fel, és az oszlopot 1 mmól magnéziumacetátot, 0,1 mmól rézacetátot és 0,01 mmól cinkacetátot tartalmazó, 1 n vizes sósa vol dattal pH= 7,8-ra állított 0,03 mólos trisz-hidroxidmetilaminometán-oldattal eluáljuk. Az eluátumot 5,4 ml-es frakciókba gyűjtjük és ezek A?65 és A280 abszorpcióját mérjük. Az 50. frakciótól kezdve ezek az abszorpciók fokozatosan emelkednek, és a 68. frakcióban csúcsot érnek el. A 66.—73. frakciók tartalmazzák az orgoteint gyógyszerkönyvi tisztaságú állapotban. A 98. frakciótól kezdve az abszorpció értéke körülbelül a 116. frakcióig nullára csökken. Az egyetlen jelentős szennyezés a 45.—60. és a 118.—150. számú csövekben jelenik meg (denaturált hemoglobin, illetve kis molekulasúlyú eritrocitakomponensek). Másik megoldás szerint 10 g, az 1. példában kapott nyers orgotein vizes oldatát alkalmazzuk egy DEAE-cellulóz (Szálas DEAE—23, Reeve— Angel) oszlopra (2,5X30 cm, ágytérfogat 147 ml), melyet pH 6,0-nál 0,005 mólos foszfátpufferral (mononátrium-dihidrogénfoszfát és dinátriumhidrogénfoszfát elegye) hoztunk egyensúlyba. Az oszlopon 240 ml/óra átfolyási sebességgel 0,005 mólos fenti foszfát puffert nyomunk át. Az orgotein elucióját 4 liter ilyen puffer átnyomásával nulláról 0,08 mól-ra emelkedő NaCl koncentráció mellett végezzük. Mérjük az eluátum Cu2+ és Zn 2 + tartalmát, és A 2 65 és A 28 o abszorpcióját, ahogy a>z a 3 763137 számú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi bejelentésben található. Három, finom szerkezettel rendelkező fő csúcs jelenik meg, kezdve 575 ml, majd 750 ml és 1425 ml gradiens eluátumnál. Az orgotein (2. csúcs) az eluátum azon részletében van jelen, ahol az A265/A280 abszorpció arány 1,27 és a Cu2 + és Zn 2 + tartalom maximális. A gradiens eluátum 750—1030 ml (0,025—0,035 mól) részlete tartalmazza lényegében az összes orgoteint igen nagy tisztaságban. A fenti példák hasonló sikerrel ismetelhetők meg, ha az azokban használt reagenseket és/vagy kivitelezési körülményeket a találmányban általánosan vagy kiemelten leírtakkal helyettesítjük. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás orgoteinben dús, lényegében homoglobin- és szénsav-anhidráz-mentes fehérje koncentrátum előállítására vörös vérsejtekből, amelynek során a hemoglobint, az orgoteint, a szénsav-anhidrázt és a vörös vérsejtek egyéb oldható fehérje-anyagait tartalmazó elegyből hőkezeléssel kicsapjuk a hemoglobint, a szénsavanhidrázt és az egyéb hőre labilis fehérjéket, azzal jellemezve, hogy a hemoglobint, a szénsavanhidrázt és az egyéb hőre labilis fehérjéket egyidejűleg választjuk le úgy, hogy a vörös vérsejteket 5 és 8 közötti pH-értéken, előnyösen Cu2 + és Zn 2 + ionok jelenlétében, . célszerűen 60—80 C°-on hőkezeljük, majd az elegyet ismert 5 módon lehűtjük, a kicsapott fehérjéket ismert módon elválasztjuk, és a felülúszóból ismert módon elkülönítjük az orgoteint. (Elsőbbsége: 1972. július 19.) 2. Eljárás orgoteinben dús, lényegében hemo-10 globin- és szénsav-anhidráz-mentes fehérje koncentrátum előállítására vörös vérsejt-forrásból, amelynek során a hemoglobint, az orgoieint, szénsav-anhidrázt és a vörös vérsejtek egyéb oldható fehérje-anyagait tartalmazó elegyből 15 hőkezeléssel kicsapjuk a hemoglobint, a szénsav-anhidrázt és az egyéb hőre labilis fehérjéket, azzal jellemezve, hogy a hemoglobint, a szénsav-anhildrázt és az egyéb hőre labilis fehérjéket egyidejűleg választjuk le úgy, hogy a vörös vér-20 sejt-forrást 5 és 8 közötti pH-értéken, előnyösen Cu2 + és Zn 2 + ionok jelenlétében, célszerűen 60—80 C°-on hőkezeljük, majd az elegyet ismert módon lehűtjük, a kicsapott fehérjéket ismert módon elválasztjuk, és a felülúszóból ismert mó-25 don elkülönítjük az orgoteint. (Elsőbbsége: 1972. november 29.) 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy vörös vérsejtként marha vörös vérsejteket használunk. (El-30 sőbbsége: 1972. július 19.) 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy vörös vérsejtként emberi vörös vérsejteket használunk. (Elsőbbsége: 1972. július 19.) 35 5. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, 'azzal jellemezve, hogy vörös vérsejtforrásként teljes vért használunk. (Elsőbbsége: 1972. november 29.) 6. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosí.„ tási módja, azzal jellemezve, hogy vörös vérsejtforrásként szérummentes vörös vérsejteket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1972. november 29.) 7. Áz 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a hőkezelést vízzel maximálisan háromszoros térfogatáig hígított kiindulási anyaggal végezzük. (Elsőbbsége: 1972. július 19.) 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az orgoteint a felülúszótól liofi-lizálással vagy ultraszűréssel 50 választjuk el. (Elsőbbsége: 1972. július 19.) 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a hőkezelést 6,8 és 7,4 közötti pH-értéken végezzük. (Elsőbb-55 sége: 1972. július 19.) 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a hőkezelést 65—75 C°-on végezzük. (Elsőbbsége: 1972. július 60 19.) 11. A 10. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a hőkezelést 75 C°-on 1—2 órán át 6,8 és 7,4 közötti pH-ér-65 téken végezzük. (Elsőbbsége: 1972. július 19.) 7
