167432. lajstromszámú szabadalom • Eljárás orgoteinben dús fehérje koncentrátum előállítására vörös vérsejtekből
167432 9 10 I. példa 200 ml térfogatú mosott marha-erythrocytát térfogatára számított kétszeres mennyiségű vízben hemolizálunk. A víz a vörös vérsejtekben jelenlevő minden 5 pig orgoteinre vonatkoztatva 1 .jug Cu2+-t és Zn 2 +-t tartalmaz. Amennyiben friss erythrocytákból indulunk ki, 7,5-ös pH-jú elegyet kapunk, míg ha állott sejtekből indulunk ki, az elegy pH-ja 7,5-nél alacsonyabb vagy magasabb érték lehet. Ez utóbbi esetben az elegy pH-ját 2 n vizes sósavoldattal vagy 2 n vizes nátriumoxid-oldattal 7,5-re állítjuk be. Az elegyet az 1. táblázatban közölt ideig 75 C°-on hőkezeljük, majd 2—3-szorosára hígítjuk, lehűtjük, és a kapott szuszpenziót 4 C°-on centrifugáljuk. A felülúszót dializáljuk és liofilizáljuk. Így nagymértékben tisztított orgoteint kapunk; a termék orgotein-tartalma 3—30%, a kiindulási anyag körülbelül 0,03%-os orgotein-tartalmához viszonyítva. A szennyezőanyagok főtömege denaturált hemoglobin. 1. táblázat Hőkezelő ideje Maradék Orgotein hemoglobin, % hozama, % 30 perc 1,5 75 45 perc 0,6 70 60 perc 0,3 70 120 perc <o,i 70 2. példa Mosott, szérummentes, fagyasztott, koncentrált ló-vörösvérsejteket térfogatukra számított kétszeres mennyiségű vízben szuszpendálunk. A szuszpenzió pH-ját ecetsavval 5,5-re állítjuk. Ez a szuszpenzió milliliterenként körülbelül 110 mg hemoglobin!, 300 meg szénsav-anhidrázt és 30 meg orgoteint tartalmaz. A szuszpenziót 15 per/ig 65 C°-on hőkezeljük, majd szobahőmérsékletre' vagy annál alacsonyabb hőmérsékletre hűtjük, és a kicsapódott fehérjéket centrifugálással eltávolítjuk. Az így kapott folyadékfázis az eredetileg jelen volt orgotein mellett 1 mg/ml-nél kisebb mennyiségű hemoglobint és 100 mcg/mlnél kisebb mennyiségű szénsav-anhidrázt tartalmaz. A folyadékfázis pH-ját 7,5-re állítjuk, és az elegyet ismét centrifugáljuk. A kapott felülúszóhoz térfogatának 3/<i-ét kitevő mennyiségű 0 C°os acetont adunk, majd az elegyet centrifugáljuk. A hemoglobin maradékát és a szénsav-anhidráz főtömegét tartalmazó csapadékot eltávolítjuk, majd a folyadékfázishoz ismét térfogatának 3/4-ét kitevő mennyiségű 0 C°-os acetont adunk. A csapadékot, amely körülbelül 50% orgoteint tartalmaz, centrifugálással elkülönítjük, majd fagyasztva szárítjuk. Az így elkülönített nyers orgoteinből a 3 579 495 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás szerinti módszerrel, Sephadex G—75 géllel végzett gélszűréssel lényegében tiszta orgoteint állíthatunk elő. A nyers orgoteint a 3 637 640 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás 3. példájában, vagy a 3 763 137 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban ismertetett módszerrel, DEAE-cellulózon végzett kromatografálással is tisztíthatjuk. 3. példa A 2. példában leírt eljárást követjük, azzal a különbséggel, hogy a 7,5-es pH-értékre beállított elegy centrifugálásakor kapott felülúszóhoz térfogatának másfélszeresét kitevő mennyiségű acetont adunk. Így mérsékelt tisztaságú orgoteint kapunk. A csapadékot az orgotein szelektív extrahálása céljából minimális mennyiségű vízzel kezeljük. Centrifugálás után körülbelül 50% orgoteint tartalmazó csapadékot kapunk. 4. példa Mindenben a 2 példában leírt eljárást követjük, azonban a hőkezelt elegyet nem centrifugáljuk, azaz az első centrifugálást a pH 7,5-re történő beállítása után végezzük. Végtermékként körülbelül 50% orgoteint tartalmazó csapadékot kapunk. 5. példa Mindenben a 2. példában leírt eljárást követjük, azonban az elegyet először csak az első aceton-részlet hozzáadása után centrifugáljuk. Végtermékként körülbelül 50% orgoteint tartalmazó csapadékot kapunk. 6. példa Az előző példák bármelyikében leírt eljárást követjük, azonban a hőkezelést körülbelül 30 percig 80 C°-on végezzük. Végtermékként körülbelül 30—50% orgoteint tartalmazó csapadékot kapunk. 7. példa Az orgotein elkülönítésére emberi vörös vérsejteken végeztünk kísérletsorozatot. Kiindulási anyagként 150 ml vízben hemolizált 50 ml mosott erythrocytát, vagy 100 ml vízben hemolizált 100 ml mosott erythrocytát használunk fel. Az elegy pH-ját 2 n vizes sósavoldattal vagy 2 n vizes nátriumhidroxid-oldattal 6,0 és 7,6 közötti értékre állítjuk be, és a mintákat legföljebb 2 órán át 75 C°-on hőkezeljük. A 7,0—7,6 pH-tartományban 1 órán át végzett hőkezelés során a hemoglobin szelektíven kiválik, és az orgoteint 40—60%-os hozammal különíthetjük el. 1 órán át végzett hőkezelés után a hemoglobin l%o-nél kisebb mennyisége marad vissza az eredeti, oldható formában. Egy további kísérletsorozatban az elegy pH-ját 7,3-ra állítjuk be, és a rendszert 2 órán át 65 C°-on hőkezeljük. A csapadékot centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszó az eredetileg je-10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
