167432. lajstromszámú szabadalom • Eljárás orgoteinben dús fehérje koncentrátum előállítására vörös vérsejtekből
167432 7 8 nyen ellenőrizhetjük a felülúszó színe alapján, ami legfeljebb halvány rózsaszín lehet. Hosszabb ideig tárolt vér esetén a hemoglo» binnak összes vörös festéke nem csapható ki, amennyiben a hőkezelést savas pH mellett végezzük. A maradék festéket kicsaphatjuk, ha az »rgotein kicsapása előtt, például a kicsapott hemoglobin eltávolítása előtt vagy után, azaz az idegen fehérjék acetonnal történő elő-kicsapásának részeként a pH-t 7-re vagy célszerűen 7— 7,5-re állítjuk be. A kicsapott vörös festéket ugyanúgy távolíthatjuk el, mint a hőkezelési lépésben kicsapott hemoglobint. A hőkezelés után a felmelegített vörös vérsejteket körülbelül 50 C° alá hűtjük, célszerűen szobahőmérsékletre vagy ennél alacsonyabb hőmérsékletre úgy, hogy hőcserélőn engedjük át. A hőkezelési lépésben kicsapott hemoglobint és egyéb fehérjéket ezután eltávolítjuk, célszerűen centrifugálással, majd eldobjuk. .Ulepítést vagy szűrést, célszerűen vákuumszűrést adott esetben segédanyaggal, mint például diatóma földdel, szintén alkalmazhatunk. A kicsapott hemoglobin eltávolítása után az orgoteint a felülúszótól, például acetonos kicsapással liofilizálással, ultraszűréssel, vagy ioncserélő oszlopon történő adszorpció és elució útján elválasztjuk. Az orgoteinnek a felülúszótól való elválasztására célszerűen ioncserélő kromatográfiai, azaz a 3 579 495 számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírásban és az abban idézett irodalomban leírt technikát alkalmazzuk. Célszerű megoldás, amelyik könnyen alkalmazható nagy mennyiségű orgotein előállítására az, hogy a hőkezelési lépésben kapott felülúszót DEAE-cellulózon engedjük át. A 0,01 mól alatti ionkoncentrációjú felülúszót DEAE-cellulózon, vagy más gyengén bázisos ioncserélő oszlopon engedjük át, ezalatt az orgotein az ioncserélő gyantán adszorbeálódik, az oszlopot vízzel vagy 0,01 mólos-nál kisebb ionerősségű pufferral mossuk, és magasabb ionerősség mellett, például 0,02—0,03 mól között az orgoteint eluáljuk. Az alkalmazott körülményektől függően nyers, aziaz 50'%-os tisztaságú vagy nagy tisztaságúig változó minőségű orgoteint eluálhatunk az oszlopról. Másik megoldás szerint a felülúszót gél kromatográfiával is tisztíthatjuk, például Sephadex G—75-el (Superfine). A berendezésen az oszlopfej cserélhető, így amikor az oszlop felső része már kapacitásának megfelelő mértékben abszorbeált orgoteint, a fej részt eltávolítjuk és friss gyantával helyettesítjük, miközben az oszlop többi része érintetlen marad. A felülúszót, proteolitikus enzim hozzáadásával az orgotein izolálás előtt előtisztíthatjuk. Meglepő módon az orgotein lényegében ellenálló a fehérjebontó enzimekkel szemben. így a felülúszóban levő nyers orgotein tisztítható oly módon, hogy az idegen fehérjéket szelektíve elbontjuk, célszerűen Strept. griseus proteinázzal, pankreatinnal, szubtilizinnel, papainnal vagy bromelainnal; a választott enzimtől és az idegen fehérje — orgoteinnek a felülúszóban levő súlyarányától függően körülbelül 1:2—1:1000 enzim — fehérje súlyarányt alkalmazunk. Az enzimmel kezelt elegyből a szokásos módon, például ultraszűréssel, tiszta vagy lényegében tiszta orgoteint izolálhatunk. Az orgotein izolálása előtt az elegyből dialízissel könnyen eltávolíthatók az enzimbontásból eredő fehérje töredékek és a fölösleges ionok. Ha a felülúszóból az orgoteint egy lépésben akarjuk eltávolítani, acetonos kicsapást alkalmazhatunk. Körülbelül az orgoteint tartalmazó folyadék térfogatára számítva 1—1,5 térfogatú aceton elegendő az összes orgotein kicsapására. Mintegy 50'%-os tisztaságú vagy annál tisztább orgoteint nyerhetünk a találmány szerinti eljárással, amennyiben az oldott fehérjéket acetonnal előzetesen kicsapjuk. Amennyiben az összes térfogathoz viszonyítva V2—3 A térfogat acetont alkalmazunk, nagyon kevés vagy semmi orgotein sem válik ki az idegen fehérjékkel együtt. A kivált idegen fehérjék eltávolítása után, ami például ugyanazon a módon történhet, ahogyan fent a kivált hemoglobin eltávolítására leírtuk, az orgoteint kicsapjuk, a maradék, azaz a vizes oldatra számítva 3/ 4 —1,5 térfogat acetonnal. Ezzel az oldószeres elő-kicsapási lépéssel azonban nagyon kevés fehérjeszerű szennyezés távolítható el, ha a hőkezelési lépést egy-két óráig pH 7-nél 75—80 C°-on végeztük, mert a kicsapás már a hőkezelési lépésben teljes volt. Az idegen fehérjék és az orgotein kicsapását előnyösen hidegen, azaz 0—5 C° közötti hőmérsékleten végezzük, de bármilyen hőmérséklet, azaz szobahőmérséklettől egészen az aceton forráspontjáig bármi alkalmazható. A találmány szerinti eljárásban acetont gaz. daságossági okokból alkalmazunk. A szakemberek számára azonban érthető, hogy akármilyen drágább, vízzel elegyedő oldószert szintén alkalmazhatunk az orgotein kicsapására, például metil-etil-ketont, tetrahidrofuránt, és ezek hatásukat tekintve egyenértékűek az acetonnal a találmány szerinti eljárásban. A kicsapott orgoteinből a maradék oldószert és nedvességet például liofilizálással, gyorsan eltávolítjuk vagy az orgotein veszteség elkerülése érdekében vizes közegből további tisztításnak vetjük alá. Bár az acetonos kicsapási technikával hemoglobin és szénsav-anhidráz mentes, orgoteinben gazdag csapadék nyerhető, a hemoglobin mentes felülúszó igen alkalmas gél-szűréses, vagy gyengén bázikus ioncserélő kromatográfiás tisztításra (lásd például a 3 579 495 és 3 763 137 sz. Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírásokban ismertetett módszereket). Azokban az esetekben, amikor nagy mennyiségű folyadék kromatografálása megvalósíthatatlan, a hemoglobin-mentes felülúszót kromatografálás előtt ultraszűréssel vagy liofilizálással töményíthetj ük be. Az orgoteint szakaszos módszerrel, gyengén bázikus ioncserélő gyantán is adszorbeáltathatjuk. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen imertetjük. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
