167432. lajstromszámú szabadalom • Eljárás orgoteinben dús fehérje koncentrátum előállítására vörös vérsejtekből
167432 5 6 értéken előnyösen 60—80 C°-on hőkezeljük, és a hőkezelést előnyösen Cu2 + és Zn 2 + ionok jelenlétében végezzük. Meglepő módon azt találtuk, hogy mind a hemoglobin, mind a szénsav-anhidráz szelektíven kicsapható, lényegében teljes mértékben, miközben az orgotein oldatban marad; a műveletnél az összes fehérjék igen jelentős részét, azaz körülbelül 95%-át kell kicsapni. Továbbá a hemoglobin hőre viszonylag állandó fehérje, a melegítés nem teszi oldhatatlanná; vagy csak részben teszi oldhatatlanná a találmány szerinti eljárásban alkalmazott pH tartományon kívül. A találmány szerinti eljárás egy különösen célszerű kiviteli módja a következő lépésekből áll: (1) a teljes vért maximálisan háromszoros, célszerűen 0,5—1,5-szeres térfogatra hígítjuk vízzel ; (2) a teljes vért körülbelül 65—75 C°-ra melegítjük, körülbelül 1—8 óra közötti időtartamra; (3) a melegített elegyet lehűtjük, legalább 40 C°-ra, célszerűen szobahőmérsékletre, vagy ez alá; •(4) a kicsapódott fehérjéket elválasztjuk, célszerűen oentrifugálással; és (5) a nyers orgoteint a felülúszóból elválasztjuk, célszerűen ioncserélő kromatográfiával. A találmány szerinti eljárás további kivitelezési megoldásánál a következő, a fenti különösen célszerű kivitelezési mód változatát alkalmazzuk : a) a hőkezelési lépés kiinduló anyagaként az 1. lépésben szérum mentes vérsejteket szuszpendálunk, célszerűen 1—3-szoros térfogatú vízben; b) a hőkezelést alacsonyabb hőmérsékleten, de hosszabb ideig végezzük, például 60 C°-on három, vagy több óra hosszat, illetve magasabb hőmérsékleten rövidebb ideig, például 80 C°-on 30 perctől egy óráig; c) a hőkezelést körülbelül pH 7 mellett végezzük ; d) a 3. lépést a 4. lépés után végezzük; e) az 5. lépésben az orgoteint a felülúszótól acetonnal, vagy más vízzel elegyedő szerves oldószerrel történő kicsapással választjuk el; f) az 5. lépésben az orgoteint a felülúszótól ultraszűréssel, vagy liofilizálással választjuk el; g) az orgotein izolálása előtt a víz egy részét eltávolítjuk a félülúszóból vákuumdesztillációval, 20—60 C° közötti hőmérsékleten. A hőkezelési lépést végezhetjük a teljes véren, ami célszerű, ugyanis így a szérum eltávolítást és a koncentrált vörös vérsejtek mosásának mechanikus lépéseit elhagyhatjuk. Ugyanezt elvégezhetjük szérum mentes vörös vérsejteken is. Ez utóbbi eljárás valamivel tisztább orgoteint biztosít, de ezt az előnyt lerontja a vörös vérsejtek hőkezelés előtti elválasztásának és mosásának költsége. A járulékos fehérje szennyezéseket kis mennyiségű további munkával, protoolitikus enzim segítségével elválaszthatjuk, amint azt az alábbiakban leírjuk, ezért tehát a teljes vért célszerű kiindulási anyagként alkalmazni. Jóllehet a hőkezelési lépést elvégezhetjük hígítatlan teljes véren vagy szérum mentes koncentrált vörös vérsejtekben, ez azonban a keverés és a hőátadás mechanikai problémáit veti fel. Ezért a teljes vért és különösen a szérum mentes vörös vérsejteket előnyös a hőkezelés előtt vízzel keverni, azaz maximálisan háromszoros, célszerűen 1—2-szeres térfogatra hígítani. A víz, ha szükséges, tartalmazhat puffert és/vagy két vegyértékű iont, azaz Cu és/vagy Zn forrást, lehetőleg alacsony koncentrációban, azaz 0,05 mól alatt. Amennyiben teljes vért használunk a hemoglobin lízise előtt a koaguláció megakadályozására, nátrium-citrátot vagy más koagulációgátlót adagolhatunk. A hőkezelési lépést célszerűen a vörös vérsejtek hemoglobinjának izoelektromos pontja, azaz pH 7 körül végezzük. Ä különböző hemoglobinok izoelektromos pontja a 6,5—7,5 pH tartományban van, rendszerint pH 6,7—7,4 között. Alacsony pH-nál, például 5 alatt a hemoglobin denaturálódik; de csak részlegesen csapódik ki. Némelyik faj, például marha és ló hemoglobin 5—8 között bármilyen pH-nál kicsapódik. Más hemoglobinok csak az izoelektromos pontjuknál csapódnak ki. A vörös vérsejtek pH-ját bármilyen alkalmas savval vagy bázissal beállíhatjuk. A hőkezelési lépést 60—80 C° között előnyösen 70—75 C°-on, addig végezzük, amíg az öszszes, vagy lényegében az összes hemoglobin ki nem csapódik. A pontos hőmérséklet és időtartam nem döntő, ha az összes hemoglobint teljesen kicsapjuk. Magasabb hőmérséklet és hoszszabb hőkezelési időtartam csökkenti az orgotein hozamot. Alacsonyabb hőmérséklet és rövidebb hőkezelési időtartam kevésbé tiszta orgoteint eredményez. 75 C°-o:n körülbelül 1—2 óra elegendő. Egy órás, vagy még hosszabb hőkezelés 60—75 C°-on, lényegesen nem befolyásolja a tiszta orgotein végső hozamát. Egy órás hőkezelés 80 C°-on azonban az orgotein 1/ i — 3 / 4 részét elbontja. A hőkezelési lépést végezhetjük szakaszosan, vagy nyújtott fűtési és hűtési időtartamok alkalmazásával, folyamatosan. A hőérzékeny fehérjéket, idetartozóan az enzimeket, a vörös vérsejtekből hő-denaturálás útján távolítjuk el a hemoglobinnal együtt. A hőérzékeny fehérjék jelentős képviselője a szénsav-anhidráz. A vörös vérsejteket addig melegítjük, amíg a szénsav-anhidráz inaktiválódik. A szénsav-anhidráz hőérzékenységéről szól az alábbi tanulmány: Davis R. P.: The Enzymes. Vol. 5. 545 (1961) Academic Press, New York 55 City. Amikor a hemoglobin kicsapódik, a szénsav anhidráz és minden, vagy csaknem minden egyéb hőérzékeny enzim és nem enzim fehérje a felülúszóban kicsapódik, minthogy a hemoglobin a stabilisabb. 60 C°-on például 20 percnél hosszabb hőkezelés már elegendő, hogy a szénsav-anhidrázt ós más hőérzékeny fehérjéket inaktiváljunk, 65 C°-on pedig 10—15 perc is elegendő. 65 A hemoglobin kicsapás befejeződését köny-10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
