167429. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2,4,6,8-dekatetraén-dikarbonsav-mono-4-(1,2-epoxi- 1,5-dimetil-4-hexenil) -5-metoxi-1-oxaspiro (2,5)okt-6-IL-észtert tartalmazó fermentlé feldolgozására

167429 3 4 veszteségek következtében gazdaságossági szempontból kedvezőtlen. A regenerálás és extrakciós műveletek költséges és sokrétű berendezéseket igényelnek. (Extraháló és desztillációs berendezések). A 151 313 sz. magyar szabadalmi leírás sok műveletből álló izolálási eljárást ismertet. A fumagillin-tartalmú fermentlé formalinos kezelése után a pH-t lúgos tartományba állítják be, majd a micéliumot eluálják, leszűrik, a pH-t 6,5 körüli értékre beállítják, az elegyet báriumkloriddal kezelik, a bárium-tartalmú csapadékot szűrik, a szürletet megsavanyítják, ezután a hatóanyagot többször extrahálják, az extraktumokat egyesítik, majd víztelenítés és szűrés után bepárolják. A maradékot, oldószerben felveszik, majd a fumagillint kicsapják és adszorpciós úton, valamint derítéssel tisztítják. Az eljárás hátránya, hogy nagymennyiségű oldószer kerül felhasználásra, a hosszú átfutási idő és a sok művelet miatt az instabil hatóanyag csak hosszabb idő elteltével kerül stabil fázisba. További hátrány, hogy sokrétű és bonyolultabb berendezésekre van szükség, mint a találmány szerinti vizes közegben végrehajtott eljárás esetében. Az eljárással továbbá mérgező báriumsókkal dolgoznak. A találmány előnyös foganatosítási módja szerint pH állításához foszforsavat alkalmazunk. Célszerűen úgy valósíthatjuk meg a fumagillin tartalmú nyers termék szárítását, hogy olyan azeotrópelegy jelenlétében végezzük azt el, melyben a víz:butilacetát — arány = 28,6:71,4. Az eljárás előnye, hogy gyors átfutási idővel stabil formában tartjuk a célterméket, A feldolgozási műveletek alatt nagyfokú tisztulás van, így a kísérő szennyeződések nem zavarják a céltermék izolálását. Az eljárás egyszerű. A feldolgozási műveletek abban a fázisban szakíthatok meg, amikor már közel 1/400-ra van koncentrálva a termék. Közelítő számadatok alapján átlagos értékeket íigyelembevéve 20 ezer liter fermentléből izolálható 4 kg céltermék. Az intermedier mennyisége kb. 50 kg, így a végfeldolgozásra több sarzsot össze lehet vonni, aminek sok előnye van, pl. munkaszervezés, jobb készülék kihasználás stb. Eljárásunk további részleteit a példákban ismertetjük. Példa Aspergillus fumigatus (dep. szám 630 704/ 23 OKI) spóratenyészetéből nyert 20 liter térfogatú 120—140 órás fermentléhez állandó kevertetés mellett adagolunk 50 ml 30% formaiint tartalmazó vizes oldatot. A fermentlé 500 gamma/ml, tehát 10 gramm fumagillin hatóanyagot tartalmaz. A továbbiakban a micéliumot tartalmazó rendszer pH értékét pH = 3,0—3,3-ra állítjuk tömény foszfor savval. A fermentlé puffer kapacitásától függően változó mennyiségű, de átlagosan 40 ml tömény foszforsav szükséges. A habzás megakadályozására 8 ml antihabzint (160 474 sz. magyar szabadalmi leírás) adagolunk. A leírt művelettel a fumagillin oldékonyságát olyan mértékben csökkentettük, hogy a vizes fázisban jelentéktelen mennyiségű céltermék található. Ezután porcelán tölcsérre Seitz papírt helyezünk, melyre 50 gramm „Hyflo" Supercel-t rétegezünk, és ezután vákuum alkalmazásával kiszűrjük a vízben oldhatatlan csapadékot, mely tartalmazza a nagytömegű micélium mellett a célterméket is. A vizes fázisban levő anorganikus és fehérje természetű hidrolizátumoktól, valamint pigmentektől mint kísérő szennyezésektől így megszabadulunk. A 20 literben levő 1 kg szárazanyag megoszlása a következő: a vizes fázisban 700 gramm, az oldhatatlan fázisban 300 gramm, tehát a fent leírt művelettel lényeges tisztulást értünk el. A kiszűrt csapadékot, amely tartalmazza az értékes hatóanyagot, 7000 ml vízben felszuszpendáljuk, amelyben előzetesen 16 gramm granulált nátriumhidroxidot oldunk. A művelet során képződik a fumagillin nátrium-sója, melynek vízold-^ hatósága több nagyságrenddel jobb, mint a fumagilliné. Ezután porcelán tölcsérre Seitz papírt és 50 gramm ,,Hyflo"-Supercel-t rétegezünk és vákuum alkalmazásával elkülönítjük a vízben oldhatatlan kísérő anyagokat az oldott állapotban levő fumagillin nátrium-sótól. Ezzel a művelettel a kiindulási térfogatot közel V:s-ra csökkentettük, a céltermék koncentrációját pedig háromszorosra növeltük. A relatíve tiszta oldat pH-ját 3,0—3,3-ra állítjuk kb. 20 ml tömény foszforsavval, melynek eredményeként a fumagillin sójából felszabadul, oldékonysága lecsökken és nagyon finom eloszlású kolloid csapadék formájában kiválik. 30 perc intenzív kevertetés után porcelán tölcsérre helyezett Seitz papíron levő 50 gramm ,,Hyflo" Supercel-re szűrjük a fumagillint vákuum segítségével. A csapadékot, amely kb. 100 gramm súlyú és szárazanyagtartalma 60%, felszuszpendáljuk 100 ml abszolút acetonban és a szuszpenziót üvegszűrőn leszűrjük. A vizes aceton minimális mennyiségű fumagillint és jelentős mennyiségű pigmentet és olajszerű szennyeződéseket tartalmaz. Az eddig leírt műveletekkel a 20 literben levő mintegy 1000 gramm súlyú szennyeződéstől gyakorlatilag megszabadulunk és a továbbiakban a 80 gramm nedves csapadékban levő 20 gramm vizet kell eltávolítani, melyet azeotrópos szárítási művelettel végzünk el. Az optimális azeotróp elegy képzése céljából a 80 gramm súlyú nedves anyaghoz 72 gramm butilacetátot adagolunk, úgyhogy homogén szuszpenziót képzünk. Váikuumszárítóban ezt 60 C°-on 8—10 órán át szárítjuk. A termék súlya 62 gramm, mely 8 gramm fumagillin hatóanyagot tartalmaz. Itt jegyezzük meg, hogy az 1000 gramm kiindulási szárazanyagból tehát 62 gramm száraz termékhez jutottunk, melyben 50 gramm „Hyflo" Supercel van, tehát olyan anyag, amely a feldolgozás további fázisaiban teljesen indiferens anyagnak fogható fel, amíg az eltávolított közel 990 gramm súlyú kísérőanyag identifikálatlan és tapasztalataink szerint a feldolgozást nagyon zavarja. A továbbiakban a 62 gramm súlyú csapadékot 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2