167411. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vízoldhatatlan fehérje-készítmények előállítására
11 167411 12 szakaszos eljárásokban tiszta szűrletek állíthatók elő, amelyek a végtermék kinyerésére alkalmazandó pótlólagos szűrés vagyis a 6-APS kinyerésénél további feldolgozás nélkül alkalmazhatók. A találmány szerint előállított hordozóhoz rögzített peni- 5 cillin-aciláz lehetővé teszi a gyors és egyszerű szűrést, mivel a mechanikai stabilitás következtében a szűrőfelületet eltömő igen finom szemcsés részecskék nem képződnek. További előnyöket jelent a gyanta viszonylag nagy fajsúlya szakaszos eljá- 10 rásban, amely egyben a gyanta gyors kiülepedését teszi lehetővé, így az eljárás befejezése után a felülúszó oldat könnyen szivornyázással eltávolítható. Ezáltal is az eljárás kivitelezése egyszerűsíthető, mivel szakaszos eljárásnál a gyanta közvet- 15 lenül a reakcióedényben marad és a következő hasításnál alkalmazható. A polimer tulajdonságai továbbá a hordozóhoz rögzített penicillin-aciláz alkalmazását teszik le- 20 hetővé nem csupán szakaszos eljárásokban, hanem folyamatos eljárásokban pl. reakcióoszlopokban, ahol a gyöngyforma a szükséges nagy átáramlási sebességet teszi lehetővé. 25 Az enzimatikus hasításnál képződött 6-APS az enzimgyanta leválasztása után a reakcióoldatból ismert eljárással pl. az 1111 778 számú NSzK szabadalmi leírás szerint nyerhető ki és 4,3 pH-értéknél kristályosítható. A penicillin találmány sze- 30 rinti hasításánál a szintén találmány szerint előállított hordozóanyaghoz rögzített penicillin-aciláz segítségével lényegesen magasabb 6-APS hozamok érhetők el, mint E. coli iszap alkalmazásánál, de a hozamok a 2 157 970 NSzK közzétételi irat sze- 35 rinti enzimgyanta alkalmazásához képest is növelhetők, így mint a 8. és 9. példában kimutatjuk, a 6-APS kb. 90%-os hozammal különíthető el. Az így előállított 6-APS szennyezésként fehérjéket sem tartalmaz. Az előállított 6-APS gyakorlati szem- 40 pontból polimermentes, amelynek jelenlétével azonban a többi módszernél számolni kell. A fehérjék vagy polimerek által okozott allergén-szerű mellékhatások a találmány szerint előállított 6-APS esetében teljes mértékben kiküszöbölhetők. 45 A találmány szerinti előállított hordozóhoz rögzített penicillin-aciláz többoldalú felhasználást tesz lehetővé hosszabb időn keresztül. Még hosszabb idő eltelte után is az enzimaktivitás gyakorlati 50 szempontból teljesen megmarad. A következő példákban megadott forráspontokat normál nyomáson határoztuk meg. 55 1 a) példa 80 g tetraetilénglikol-dimetakrilát, 20 g maleinsavanhidrid és 1 g azo-izovajsavnitril keverékét 1 liter benzolban feloldjuk és keverés közben 4 óra 60 leforgása alatt 60 C°-on melegítjük. Ezután hozzáadunk 1 g azo-izovajsavnitrilt és 200 ml 100-140 C° forráspontú benzint, majd a reakcióelegyet 5 óra hosszat 70 C°-on polimerizáljuk. A kapott porszerű polimereket leszívatjuk, egyszer 65 benzolban és háromszor 30-50 C° hőmérsékletű petroléterben szuszpendáljuk, majd tisztítás után vákuumban megszárítjuk. Hozam: 94g Térfogatsúly: 3,5 ml/g Duzzadási térfogat vízben: 4,7 ml/g Fajlagos felület: 5m2 /g Savtartalom az anhidrid-csoportok elszappanosítása után: 3,5 milliekvivalens/g. 1 b) példa 1 g 1 a) példa szerint előállított hordozógyantát 132 mikrogram penicillin-aciláz (specifikus aktivitása 1 E/mg fehérje biuret) 30 ml vízben képzett oldatában szuszpendáljuk. A 6,3-ra beállított pH-érték állandó értéken tartása mellett 1 n nátriumhidroxiddal és pH szabályzó segítségével a szuszpenziót 20 óra hosszat 25 C°-on keverjük. Végül a reakcióelegyet G 3 üvegszűrőn szűrjük és a gyantát 50-50 ml 0,05 mólos 7,5 pH értékű, 1 mól nátriumkloridot tartalmazó és nátriumkloridtól mentes foszfátpufferral mossuk. További mosással a gyanta aktivitása már nem változik. Enzimatikus aktivitás értékek (NIPAB-teszt): Kiindulási oldat: Felülúszó rész + mosóvíz: Hordozógyanta a reakció után: 132 egység 12 egység 86 egység, vagyis ez a kiindulási aktivitás 65%-a. A penicillin-aciláz enzimatikus aktivitását kolometriás vagy titrimetriás úton 0,002 mólos 6-nitro-3-(N-fenilacetil)-aminobenzoesav (NIPAB) szubsztrátummal 7,5 pH-értéken és 25 C°-on mérjük. A képződő 6-nitro-3-aminobenzoesav moláris extinkciós együtthatója E40Snm =9090. 1 egység (E) megfelel 1 mikromól szubsztrátum átalakítására 1 perc alatt. 2 a) példa 90 g etilénglikol-dimetakrilát, 10 g maleinsavanhidrid és 1 g azo-izovajsavnitril 1 liter benzolban készült oldatát keverés közben először 60 C°-on polimerizáljuk. 4 óra eltelte után a reakcióelegyhez 200 ml (100-140 forrpont hőmérsékletű) benzint és 1 g azo-izovajsavnitrilt adunk hozzá, majd az elegyet 2 óra hosszat 70 C°-on, végül 2 óra hosszat 80 C°-on tovább polimerizáljuk. Végül a polimereket leszívatjuk, a termékeket 30—50 C° forráspont hőmérsékletű petroléterrel alaposan kimossuk, majd vákuumban szárítjuk. Hozam: 97 g Térfogatsúly: 6,4 ml/g Duzzadási térfogat vízben: 8,0 ml/g Fajlagos felület: 298m2 /g Savtartalom az anhidrid-csoportok elszappanosítása után: 1,5 milliekvivalens/g. 6
