167361. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hidroxokobalamin és sóinak előállítására
3 167361 4 A katalitikus redukciónál visszamaradó átalakítatlan termék abból adódik, hogy a molekuláról lehasadt, de a még oldatban levő cianidcsoport a redukció befejeztével újból a kobalamin molekulán megkötődik. A molekula károsodása, valamint cianokobalamin visszahagyása nélkül végzik a katalitikus hidrogénezést a 153 741 számú magyar szabadalmi leírás szerint vizes alkoholos közegben lOatm feletti nyomáson. A redukció folyamán lehasadó cianidcsoport ennél az eljárásnál mennyiségileg metilaminná alakul át. Az eljárás hátránya, hogy a redukciót a légkörit meghaladó nyomáson kell végezni. A 974 284 számú angol szabadalmi leírás szerint a cianokobalamint vizes oldatban alkáli hidrogén szulfittal reagáltatják, a kapott szulfitokobalamint nitrit-ion felesleggel nitritokobalaminná alakítják át, majd ezt erősen savanyú közegben szulfaminsawal megbontják és így hidroxokobalamint kapnak. Az eljárás egyik hátránya, hogy a reaktánsként alkalmazott szulfaminsav, mint erős ásványi sav, a több órás kezelés folyamán a kobalamin molekulát károsítja. Ilyenkor dezamidálás révén a hidroxokobalamin karbonsavas származéka, az úgynevezett aníagonista hatású Bi2 -vitamin, illetve a nukleotid-csoport lehasadásával a kobinamid (B faktor) dihidroxo-származéka keletkezik. További hátránya az eljárásnak az, hogy a reakcióelegyben képződött hidroxokobalamin, mint gyenge bázis, a rendszerben levő különféle savakkal sókat képez. így egyidejűleg hidroxokobalamin-acetát és hidroxokobalamin-szulfát képezi a főterméket, továbbá szennyezésként megtalálható az oldatban a kiindulási cianokobalamin, valamint a reakció közbülső termékeiből visszamaradó szulfíto-kobalamin és nitrito-kobalamin, melyek mind jelen vannak a végtermékben. Ezeket különféle ioncserélő sajátságú papíroszlopon kell elkülöníteni. A hidroxokobalamin valamely egységes sójának kialakítása céljából vagy ioncserélő oszlopon végzett tisztítást alkalmaznak, vagy a szerves oldószerben levő hidroxokobalamint többször átmossák olyan lúg vizes savoldattal, — így sósav vagy kénsav oldatával — amelynek savmaradékával kívánják a hidroxokobalamin sójának kialakítását. Ez a megoszlás azonban nem mennyiségi, tehát a fő terméket mindig szennyezi valamely egyéb só. Azt találtuk, hogy a szennyezéstől mentes, egységes hidroxokobalamin só közvetlenül előállítható kristályos nitritokobalamin gyengén savanyú vizes oldatából, ha azt azonos savmaradékot tartalmazó ammónium-, és hidroxilammónium-sókkal együttesen reagáltatjuk. A gyengén savanyú oldat pH-értékét értelemszerűen a kívánt savmaradékkal rendelkező savval állítjuk be, vagy adott esetben a hidroxokobalamin bázist a reakciókeverék lúgosításával felszabadítjuk, kívánt esetben a kapott hidroxokobalamin sót vagy a szabad bázist más sóvá alakítjuk át. A találmány tárgya eljárás hidroxokobalamin és sóinak előállítására cianokobalaminnak szulfitionokkal szulfitokobalaminná, a kapott szulfitokobalaminnak nitritionokkal nitritokobalaminná való átalakítása és a kapott nitritokobalaminnak valamely salétromossavat megbontó vegyülettel történő megbontása útján, azzal jellemezve, hogy a nitritokobalamint vizes közegben valamely ammónium-só 5 és célszerűen azonos savmaradékot tartalmazó hidroxil-ammónium-só együttes alkalmazásával 2,5—6,5 pH értékek között, előnyösen 4,2 pH értéknél, 40—60 C°-on megbontjuk, majd a reakciókeverékből a képződött hidroxokobalamin sót ön-10 magában ismert módon kinyerjük, adott esetben a hidroxokobalamin bázist felszabadítjuk, kívánt esetben a hidroxokobalamin sót vagy a szabad bázist más sóvá, előnyösen acetát, formiát, klorid, szulfát, glicinát, aszparaginát, pantotenát vagy folát sóvá 15 alakítjuk át. A találmány szerint oly módon járunk el, hogy a kristályos nitritokobalamint 75 C -os vízben feloldjuk, majd 60C°-ra lehűtve, állandó keverés 20 közben részletekben valamely ammónium sót és azonos savmaradékot tartalmazó hidroxil-ammónium sót, például -kloridot, -szulfátot, -acetátot vagy -formiátot adagolunk az oldathoz és az oldat pH-értékét a megfelelő híg vizes savoldattal 4,0-ra 25 állítjuk. Kétórai keverés után az oldatot szobahőmérsékletre hűtjük le, és a keletkezett hidroxokobalamin sót 1:1 térfogatarányú fenol-kloroform eleggyel kivonatoljuk. Az elválasztott szerves oldószeres fázist vízzel átmossuk, a hatóanyagot tar-30 talmazó szerves oldószeres fázisból a keletkezett hidroxokobalamin sót kloroform, aceton és víz hozzáadásával vizes fázisba visszük át, melyből acetonnal kristályosítjuk. Az eljáráshoz szükséges bármely hidroxil-am-35 mónium-sót oly módon állíthatjuk elő, hogy valamely kereskedelmi hidroxil-ammónium-sót, például hidroxil-ammónium-kloridot a kívánt aniont tartalmazó anioncserélő gyantán, például formiát ciklusú gyantán engedjük át. 40 A kiindulási termékként alkalmazott nitrito-kobalamin, mint kristályos termék, könnyen előállítható kobalamin tartalmú mikroorganizmusokból, amikor a sejtekből történő kinyerésnél nitrit-iono-45 kat alkalmazunk cianid helyett, a kivonatot feldúsítjuk, majd kristályosítjuk (890 265 számú NSZK-beli szabadalmi leírás). A nitritokobalamin előállítható még a 164 659 50 lajstrom számú szabadalmi leírás vagy a 974 284 számú angol szabadalmi leírás szerint előállított szulfitokobalaminból oly módon, hogy azt a 974 284 számú angol szabadalmi leírásnak megfelelően nitrit-ion felesleggel nitritokobalaminná ala-55 kítjuk át. A találmány egy másik változata szerint oly módon járunk el, hogy a kristályos nitrito-kobalamint 75C°-os vízben feloldjuk, majd 60C°-ra lehűtve, állandó keverés közben több részletben 60 ammónium-klorid és hidroxilammónium-klorid keverékét adagoljuk hozzá és az oldat pH értékét híg vizes sósav oldattal 2,5-re állítjuk. Két óra múlva a keverést megszüntetjük, az oldatot szobahőmérsékletre hűtjük le, pH értékét 2 n nátriumhidroxid 65 oldattal 9,0-re állítjuk, majd az így felszabadított 2
