167360. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mindkét láncvégen alfa-aminooxi-karbonsavat tartalmazó ACTH hatású polipeptidek előállítására
19 167360 20 (0,5 mmol) N-metilmorfolint, majd 0,210 g (1,0 mmol) DCC-t. A reakcióelegyet egy napig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd a DCU-t kiszűrjük és a szűrletet 100 ml éterrel hígítjuk. Akicsapódott terméket szűrjük, éterrel mossuk, 5 szárítjuk 1,40 g (97%) védett, aminooxikarbonsavval helyettesített oktadekapeptidamidot kapunk. Op.: 170-178 C°, R?=0,52. 5. példa H-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-OGly-NH2 15 0,400 g (0,134 mmol) BOC-D-Oser-Tyr-Ser-Met-Gl u( 0 Bu * )-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC>Lys(BOC>Lys(BOC>OGly-NH2 . < HCl-ot 3,2 ml trifluorecetsav, 0,4 ml anizol 20 és 0,4 ml víz elegyében oldunk. Az oldatot 1 óra után 80 ml éterrel hígítjuk és a kivált csapadékot leszűrjük. A nyers nonadekapeptidamid-trifluoracetátot 5 ml vízben oldjuk és karboximetilcellulóz (Whatman CM-52) ioncserélőből készített 25 3,5x56 cm-es oszlopon 1,5 liter 0,2 mól (pH 6,7) és 1,5 liter 0,6 mól (pH 6,7) ammóniumacetát pufferból készített lineáris puffergradienssel kromatografáljuk. A terméket tartalmazó 78-86. frakciókat összegyűjtjük és liofílizáljuk. 0,166 g (41,5%) 30 aminooxikarbonsawal helyettesített nonadekapeptidamidot kapunk. Rf = 0,22, peptid tartalom: 76%, metionin-szulfoxid tartalom: 2,3%, Tyr/Trp arány: 0,97, aminosav analízis: Lys 4,5 (5), His 1,0 (1), Arg 0,9 (1), Ser 0,85 (1), Glu 1,0 (1), Pro 35 1,0 (1), Gly 1,9 (2), Val 0,85 (1), Met 0,75 (1), Tyr 0,95 (1), Phe 1,0 (1). A kiinduló anyagként használt védett, aminooxikarbonsawal helyettesített nonadekapeptidamid-hidrokloridot az alábbi módszerrel készítjük: 40 1. lépés: Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC> 45 Lys(BOC)-OCH3 51 g (60 mmól) Z-Lys(BOC>Lys(BOC)--Ly<BOC)-OCH3 -t 100 ml metanolban oldunk és 10 g 10%-os csontszenes palládium katalizátor je- 50 lenlétében hidrogénezzük. A reakció befejeződése után a katalizátort kiszűrjük, és az oldatot vákuumban bepároljuk. A maradékot 240 ml etilacetátban oldjuk, 28,5 g (60 mmól) Z-Ly<BOC)-OSu-t adunk hozzá és szobahőmérsékleten állni hagyjuk. 55 Két óra után a reakcióelegyhez 1000 ml etilace tatot és 200 ml vizet adunk, összerázás után a vizes részt elválasztjuk, az etilacetátos oldatot kétszer 200 ml n sósavval, kétszer 200 ml 8%-os nátriumhidrogénkarbonát-oldattal mossuk, majd szá- 60 rítás után bepároljuk. A maradékot éterrel eldörzsöljük, szűrjük, éterrel mossuk. A nyers terméket etilacetátból átkristályosítjuk. 52,05 g (81%) Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCH3-t kapunk. Op.: 122-123 C5. 65 2. lépés: H-Lys(BOC>Lys(BOC)-Lys(BOC> -Lys(BOC)-OCH3 35 g (32,4 mmól) Z-Lys(BOC)-Lys(BOC> -Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCH3 -t 700 ml metanolban oldunk és 7g 10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A reakció befejeződése után a katalizátort kiszűrjük, az oldatot bepároljuk és a maradékot éter-diizopropiléter elegyével megszilárdítjuk. Szűrés, szárítás után a nyers terméket éter-dlizopropil-éter elegyéből átkristályosítjuk. 24,8 g (81%) H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCH3 -t kapunk. Op.: 101-103 C°. 3. lépés: Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC>Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCH3 24 g (25,4 mmól) H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCH3 -t és 4,7 ml (33,6 mmól) trietilamint 180 ml diklórmetánban oldunk, 8,5 g (30,5 mmól) tritilkloridot adunk hozzá és szobahőmérsékleten állni hagyjuk. 24 óra után a diklórmetánt ledesztilláljuk és a maradékhoz 500 ml etilacetátot és 100 ml vizet adunk. Összerázás után a vizes réteget elválasztjuk, az etilacetátos oldatot háromszor 100 ml 5%-os citromsav-oldattal és háromszor 100 ml 8%-os nátriumhidrogénkarbonát-oldattal kirázzuk, majd szárítás után bepároljuk. A maradékot éterrel eldörzsöljük, szűrjük, diizopropiléterrel, petroléterrel mossuk, 23,6 g (78,5%) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC> -OCH3 -t kapunk. Op.: 166-168 C°. 4. lépés: Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC>Lys(BOC> Lys(BOC>N2 H 3 23,3 g (19,6 mmól) Tri-Lys(BOC)-Ly<BOC)•Lys(BOC)-Lys(BOC>OCH3 -t 230 ml metanolban oldunk, 5,7 ml (117 mmól) hidrazinhidrátot adunk hozzá és szobahőmérsékleten- állni hagyjuk. Négy nap múlva a metanolt ledesztilláljuk, a maradékot éterrel eldörzsöljük, szűrjük, vákuumban szárítjuk. 23,0 g (98%) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)--Lys(BOC)-Lys(BOC)-N2 H 3 -t kapunk. Op.: 217-219 C°. 5. lépés: Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OGly-NH2 2,37 g (2,0 mmól) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC> -Lys(BOC)-Lys(BOC>N2 H 3 -ot feloldunk 12 ml dimetilformamidban. A —20 C°-ra hűtött oldatba keverés közben becsepegtetünk 2 ml (8,0 mmól) 10
