167360. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mindkét láncvégen alfa-aminooxi-karbonsavat tartalmazó ACTH hatású polipeptidek előállítására
21 167360 22 4 n etilacetátos sósav-oldatot, majd 0,28 ml (2,35 mmól) terc-butilnitritet. A reakcióelegyet 5 percig -10 C°-on tartjuk, majd -20 C°-ra hűtjük és hozzáadjuk 0,216 g (2,4 mmól) H-OGly-NH2 [Riedl, Frank. Monatshefte 92 730 (1961)] és 1,03 ml (6,0 mmól) diizopropiletilamin 8,0 ml dimetilformamidos oldatát. A reakcióelegyet 2 órán át -5 és 0C° közötti hőmérsékleten, majd másnapig 0C°-on tartjuk. Ezután az oldatot bepároljuk, a maradékot vízzel eldörzsöljük, szűrjük, vízzel mossuk. 2,35 g (94%) Tri-Lys(BOC> -Ly<BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC>OGly-NH2 -t kapunk. R? = 0,72. 6. lépés: H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC> -Lys(BOC)-OGly-NH2 • HCl 1,75 g (1,4 mmól) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC> -Lys(BOC>Lys(BOC)-OGly-NH2 -t 35 ml 80%-os vizes ecetsavban oldunk. Az oldatot 1 óra múlva bepároljuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük. Szűrés, éteres mosás, szárítás után a nyers terméket 3,2 x 52 cm-es kovasavgél-oszlopon etilacetát-(piridin : ecetsav : víz = 20 : 6 : 11) 4:1 arányú elegyével kromatografáljuk, Az elutumot 15 ml-es frakciókban gyűjtjük és összetételüket vékonyrétegkromatográfiával vizsgáljuk. A tiszta terméket tartalmazó 105—112. frakciókat összegyűjtjük, és az oldószert ledesztilláljuk, a maradékot éterrel eldörzsöljük, majd szűrés, szárítás után 20 ml metanolban oldjuk és hozzáadunk 0,22 ml piridin és 0,22 ml tömény sósav elegyítésével nyert piridin-hidroklorid-oldatot. Ezután a metanolt ledesztilláljuk, a maradékot éterrel eldörzsöljük, szűrjük, vákuumban szárítjuk. 0,95 g (65%) H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC>OGly-NH2 • HCl-ot kapunk. R? = 0,18. 7. lépés: BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GluíOBu*)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC>Lys(BOC>Lys(BOC> -OGly-NH2 • HCl 0,398 g (0,20 mmól) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu*)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH • HCl-ot, 0,208 g (0,20 mmól) H-Lys(BOC>Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC>OGly-NH2 -HCl-ot és 0,165 g (0,90 mmól) pentafluorfenolt 4 ml dimetilformamidban feloldunk és 0,022 ml (0,20 mmól) N-metilmorfolint, majd 0,063 g (0,30 mmól) DCC-t adunk hozzá. A reakcióelegyet 16 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd a DCU-t kiszűrjük és a szűrletet éterrel hígítjuk. A kivált terméket szűrjük, éterrel mossuk, vákuumban szárítjuk. 0,540 g (91%) védett nonadekapeptidamid-hidrokloridot kapunk. Rf =0,63. 6. példa H-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-5 -OGly-OBzl 0,400 g (0,130 mmól) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu*)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-10 -Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC>Lys(BOC)-OGly-OBzl • HCl-ot 3,2 ml trifluorecetsav, 0,4 ml anizol és 0,4 ml víz elegyében oldunk. Az oldatot 1 óra után 80 ml éterrel hígítjuk és a kivált csapadékot leszűrjük. A nyers nonadekapeptidamid 15 trifluoracetátot 5 ml vízben oldjuk és karboximetilcellulóz (Whatman CM-52) ioncserélőből készített 3,5x52 cm-es oszlopon 1,5 liter 0,2 mól (pH 6,7) és 1,5 liter 0,6 mól (pH 6,7) ammóniumacetát pufferből készített lineáris puffergradienssel kromatog-20 rafáljuk. A terméket tartalmazó 80-93. frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. 0,151 g (39%) aminooxikarbonsawal helyettesített nonadekapeptidamidot kapunk. Rf = 0,28, peptid tartalom: 80%, metionin-szulfoxid tartalom: 1,9%, Tyr/Trp arány: 25 1,05, aminosav analízis: Lys 4,5 (5), His 0,95 (1), Arg 1,0 (1), Ser 0,8 (1), Glu 1,0 (1), Pro 1,0 (1), Gly 1,95 (2), Val 0,95 (1), Met 0,8 (1), Tyr 0,95 (1), Phe 1,0 (1). 30 A kiinduló anyagként használt védett aminooxikarbonsawal helyettesített nonadekapeptidamid hidrokloridot az alábbi módszerrel készítjük: 1. lépés: BOC-OGly-OBzl 40 3,8 g (20 mmól) BOC-OGly-OH-t (165 117 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás) 5 ml dimetilformamidban oldunk, 4,44 ml (40 mmól) trietilamint és 7,8 ml (66 mmól) benzilbromidot adunk hozzá. A reakcióelegyet 8 órán át forró vízfürdőn 45 melegítjük, majd másnapig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ekkor 100 ml etilacetáttal hígítjuk, 50 ml vízzel és háromszor 20 ml 8%-os nátriumhidrogénkarbonát-oldattal mossuk. Szárítás után az etilacetátot ledesztilláljuk és a maradékot éterből 50 átkristályosítjuk. 4,5 g (80%) BOC-OGly-OBzl-t kapunk. Op.: 79-80C. ^ 2. lépés: H-OGly-OBzl • HCl ll,2g (40 mmól) BOC-OQy-OBzl-t 22 ml etil-60 acetátban oldunk és 22 ml 4 n etilacetátos sósav-oldatot adunk hozzá, 30 perc után a reakcióelegyet bepároljuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük. Szűrés, szárítás után a nyers terméket etilacetátból átkristályosítjuk. 5,7 g (66%) OGly-OBzl • HCl-ot 65 kapunk. Op.: 85-87 C°. 11
