167360. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mindkét láncvégen alfa-aminooxi-karbonsavat tartalmazó ACTH hatású polipeptidek előállítására
5 167360 6 Eljárhatunk azonban úgy is, hogy a megfelelően védett C-terminális aminooxikarbonsav származékot megfelelően védett 15-17-es tripeptiddel vagy 15—18-as tetrapeptiddel acilezzük és az így kapott helyettesített peptidszármazékot —az N-terminális 5 védőcsoport szelektív eltávolítása után — a megfelelően védett és az N-terminális láncvégen aminooxikarbonsawal helyettesített tetradekapeptiddel kondenzáljuk és így jutunk a kiindulási anyagként használt mindkét terminálisán aminooxikarbonsavat 10 tartalmazó védett pepiidhez. A szintézis végén az N-terminális a-aminooxicsoporton és az oldalláncok aminocsoportjain levő terc-butiloxikarbonil-csoportot, az oldalláncok karboxilcsoportján és, amennyiben nincs amidálva, a C-terminális karboxilcsopor- 15 ton levő terc-butilészterícsoportot és az oldallánc hidroxilokon esetleg jelenlevő terc-butiléter-csoportot egyidejűleg acidolízissel, például trifluorecetsavas kezeléssel hasítjuk le. Ha a kiindulási anyagként használt védett peptid trifluorecetsawal 20 nem hasítható védőcsoportot, például formil-csoportot is tartalmaz, ezt a többi védőcsoport eltávolítása előtt vagy után külön lépésben távolítjuk el. A védőcsoportjaitól megszabadított végtermék tisztítása történhet ellenáramú megosztással 25 vagy oszlopkromatográfiás módszerrel például különböző karboximetilcellulóz-féleségeken végzett ioncserélő kromatográfiával. Az új vegyületeket az előállítás során alkalmazott módszertől függően szabad bázisok vagy 30 sók formájában kapjuk. Ásókból a bázisok önmagukban ismert módszerekkel szabadíthatók fel. A szabad bázisok viszont gyógyászati célokra alkalmazható savakkal savaddíciós sókká alakíthatók. E célra szervetlen savakat, mint sósav, kénsav és 35 foszforsavak és szerves savakat is, mint hangyasav, ecetsav, magasabb zsírsavak, tejsav, bórkősav, citromsav stb. alkalmazhatunk. A találmány szerinti eljárással készült peptidek a szokásos gyógyszerkészítmények formájában kerül- 40 hétnek gyógyászati felhasználásra. Az ilyen gyógyszerkészítmények a találmány szerinti vegyületeket enterális vagy parenterális beadásra alkalmas szerves vagy szervetlen vivőanyag kíséretében tartalmazzák, így a gyógyszerkészítmények lehetnek szilárd lio- 45 filizátumok, mikor is vivőanyagként peptidekkel nem reagáló vegyületek például mannit, tejcukor, keményítő jöhetnek számításba, lehetnek szuszpenziók és emulziók, melyek különböző semleges tartósító, stabilizáló segédanyagokat is tartalmaz- 50 nak. Különösen előnyös, ha a gyógyszerkészítmény a találmány szerinti vegyületeket komplex formájában tartalmazza, melyek a készítménynek elhúzódó hatást biztosítanak. Komplexek alatt a találmány szerinti eljárással 55 készült peptidek olyan vegyületei értendők, amelyek bizonyos szerves és szervetlen anyagok hozzáadására keletkeznek. Ilyen szerves vegyületek lehetnek például bizonyos zselatinok, karboximetilcellulózok, alginsav-észterek, polifloretinfoszfát, 60 aminosav polimerek vagy egyéb polimerek és kopolimerek. A szervetlen vegyületek közül bizonyos fémek, elsősorban a cink hidroxidja, és nehezen oldható sói, mint foszfátjai vagy pirofoszfátjaj jöhetnek számításba. 6S A gyógyszerkészítmények a találmány szerinti vegyületeket, elsősorban a leghatásosabbnak bizonyult D-OSer1 , Lys 17 , Lys 18 , OGly19 -ai-i9-ACTH-OGly 19 -NH 2 -t az adrenokortikotrop hormon szokásos dózisának megfelelően 0,5-2 mg/ml koncentrációban tartalmazzák. Ezeket szubkután, intramuszkulárisan vagy parenterálisan adagolhatjuk hetente 1-7-szer. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik. A példákban az aminosav és peptidszármazékok jelölésére használt rövidítések a IUPAC-IUB által ajánlottak [J. Bil. Chem. 247 977 (1972)]. Az a-aminooxikarbonsavak jelölésére az aminosav rövidítésekhez hasonlóan alkalmazva használjuk az OSer (a-aminooxi-/3-hidroxipropionsav), OLys (a-aminooxi-e-aminokapronsav) és OGly (aminooxi-ecetsav) megjelöléseket. A fenti rövidítések a Gly kivételével, hacsak nincs külön jelölve, az L-antipódokra vonatkoznak. Egyéb rövidítések: PCPOH = pentaklórfenol, PFPOH = pentafluorfenol, DCC = diciklohexil-karbodiimid, DCU = diciklohexil-karbamid, BOC = terc-butiloxikarbonil, Bu*=terc-butil, For = formil, ONSu = szukcininíidiloxi, Tri = tritil, Bzl = benzil. Az olvadáspont meghatározások dr. Tottoli-féle készülékben (Büchi, Schweiz) történtek. A vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatokat „Silicagel nach Stahl" adszorbensen végeztük az alábbi oldószerelegyekben: 1. etilacetát: (piridin : ecetsav : víz 2. etilacetát: (piridin: ecetsav : víz 3. etilacetát: (piridin : ecetsav : víz 4. etilacetát: (piridin : ecetsav : víz 5. n-butanol: piridin : ecetsav : víz 6. etilacetát: piridin : hangyasav : víz = 20:6:11) = 99:1 = 20:6:11)= 8:2 = 20:6:11)= 6:4 = 20:6:11)= 9:1 = 30 : 20 : 6 : 24 = 50 : 20 : 6 : 5,5 A peptidek ioncserélő kromatográfiás tisztításánál az elutumot UVICORD II (LKB, Svédország) átfolyó küvettás ultraibolya extinkcióméteren átvezetve folyamatosan regisztráltuk az elutum fényelnyelését 280nm-en. Az elutumot 25 ml-es frakciókban gyűjtöttük. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat az elnyelési görbe alapján választottuk ki. 1. példa H-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-OLys-NH2 0,75 g (0,267 mmol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GluíOBu^-His-Phe-Arg-Trp-Gly-LysíBOCÍ-Pro-Val•Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OLys(For)-NH2-ot feloldunk 6 ml trifluorecetsav, 0,75 ml víz és 3
