167360. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mindkét láncvégen alfa-aminooxi-karbonsavat tartalmazó ACTH hatású polipeptidek előállítására
7 167360 8 0,75 ml anizol elegyében, majd az oldatot 1 órai állás után 150ml éterrel hígítjuk. Akivált csapadékot szűrjük, éterrel mossuk, foszforpentoxid és káliumhidroxid mellett vákuumban szárítjuk. Az így kapott 0,70 g (86%) aminooxikarbonsawal helyettesített formil-oktadekapeptidamid-trifluoracetátot 10 ml vízben feloldjuk, az oldathoz 0,25 ml merkaptoetanolt adunk, pH-ját n nátriumhidroxid-oldattal 5-re állítjuk, majd 11,5 ml 2 mól hidrazinacetát-oldattal elegyítve 2 órán át 95C°-os vízfürdőben tartjuk. Ezután vákuumban besűrítjük és karboximetilcellulóz (Whatman CM 52) ioncserélőből készített 4,5 x 57 cm-es oszlopra öntjük, majd 2 liter 0,2 mól (pH 6,7) és 2 liter 0,5 mól (pH 6,7) ammóniumacetát pufferből készített lineáris puffergradienssel 80 ml/óra sebességgel eluáljuk. A terméket tartalmazó 98-105. frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. 0,275 g (38%) arninooxikarbonsawal helyettesített oktadekapeptidamidot kapunk. Rf5 = 0,28. A kiinduló anyagként használt védett, aminooxikarbonsawal helyettesített oktadekapeptidamidot az alábbi módszerrel készítjük: 1. lépés L-a-terc-butiloxikarbonil-aminooxi-e-formilamino-kapronsav [BOC-OLys(For)] € 23,2 (60 mmól) N-e-formil-D-lizint és 43,2 (423 mmól) nátriumbromidot feloldunk 248 ml 2,5 n kénsavban. Az oldatot 0 C°-ra hűtjük és keverés közben harminc perc alatt, részletekben hozzáadunk 13,3 g (192 mmól) nátriumnitritet. A reakcióelegyet egy órán keresztül 0 C°-on, egy órán keresztül szobahőmérsékleten keverjük, majd háromszor 200 ml éterrel kirázzuk. Az egyesített éteres oldatot szárítás után bepároljuk. A visszamaradó 18,4 g nyers D-a-bróm-e-formilamino-kapronsavat 190 ml etanolban feloldjuk, 8,4 g (150 mmól) káliumhidroxidot és 10,0g (76 mmól) terc-butiloxikarbonilhidroxilamint adunk hozzá. A reakcióelegyet 2 órán forraljuk, majd másnapig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ekkor az oldószert ledesztilláljuk, a maradékot 80 ml vízben oldjuk és az oldaf pH-ját 10%-os sósavval 3-ra állítjuk. A savanyú oldatot nátriumkloriddal telítjük, és háromszor 150 ml éterrel, majd 150 ml etilacetáttal kirázzuk. Az egyesített éteres-etilacetátos oldatot szárítás után bepároljuk. A kristályos maradékot (16 g) 25 ml etilacetátból átkristályosítjuk. 10,4 g (27%) L-a-terc-butiloxikarbonil-aminooxi-e-formüamino-kapronsayat kapunk, op.: 114-116.C°, Rf 2 = 0,31, [a]D =-52,5° (c=l, metanol). Elemzés a C12 H 22 N 2 0 6 összegképlet alapján: számított: C =49,6%, H =7,65%, talált: C = 49,9%, H = 7,6%. 2. lépés: L-a-terc-butüoxikarboml-ammooxi-e-formilaminokapronsavamid [BOC-OLys(For>NH2 ] 5 5,0 g (17,2 mmól) BOC-OLys(For)-t feloldunk 107 ml vízmentes tetrahidrofuránban, 1,90 ml (17,2 mmól) N-metilmorfolint adunk hozzá, majd —10C°-ra hűtjük és keverés közben hozzácsepeg-10 tétünk 2,25 ml (17,2 mmól) klórszénsav-izobutilésztert. A reakcióelegyet 10 percig ezen a hőmérsékleten tartjuk, majd —20C°-ra hűtjük le, óvatosan belecsepegtetünk 10,7 ml (142 mmól) tömény ammóniumhidroxid-oldatot és egy órán át 15 0C°-on, egy órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a tetrahidrofuránt ledesztilláljuk és a félig kristályos maradékot 20 ml etilacetát: piridin : ecetsav : víz =900 : 54 : 16 : 30 arányú eleggyel hígítva 2,5 x 50 cm-es kovasavgél oszlopra öntjük. Az osz-20 lopót a fenti eleggyel eluáljuk, az eluátumot 10 ml-es frakciókban gyűjtjük és összetételüket vékonyrétegkromatográfiával vizsgáljuk. A tiszta terméket tartalmazó 59-67: frakciókat összegyűjtjük és az oldószert ledesztilláljuk. 4,3 g (86%) 25 BOC-OLys(For)-NH2 marad vissza enyhén sárga amorf anyag formájában. R? = 0,54. 3. lépés: 30 terc-Butiloxikarbonil-D-a-aminooxi-/3-benziloxipropionsav 48,4 g (0,364 mól) terc-butiloxikarbonil-hidroxilamint, 40,7 g (0,728 mól) káliumhidroxidot és 35 94,0 g (0,364 mól) DL-a-bróm-/3-benziloxipropionsavat 360 ml vízben oldunk, és a reakcióelegyet 3 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután az oldat pH-ját 3-ra állítjuk és háromszor 720 ml éterrel kirázzuk. Az éteres oldatot 720 ml vízzel 40 rázzuk ki, majd szárítás után 78 ml (0,40 mól) diciklohexilamint adunk hozzá. A kapott 43,61 g terc-butiloxikarboml-DL-a-aminooxi-ß-benziloxipropionsav-diciklohexilaminsót (op.: 144—146 C°) 500 ml éterben szuszpendáljuk és ötször 100 ml 45 0,2 n kénsawal rázzuk ki. Az éteres oldatot szárítás után szárazra pároljuk, a maradékot 700 ml etanolban oldjuk és 6,56 g (48,5 mmól) (+)-amfetamin bázist adunk hozzá. Az oldatot éjjelen át hidegen állni hagyjuk, a kivált kristályokat szűrjük. A nyert 50 terc-butiloxikarbonil-D-a-aminooxi-/3-benziloxipropionsav-(+)-amfetaminsót etanolból átkristályosítjuk. Termelés: 13,27 g op.: 188-191 C°, [aJo6 = +54° (c = 0,5, metanol). A só megbontásával 7,9 g (14%) terc-butiloxikarbonil-D<*-aminooxi-j3-55 -benziloxipropionsavat kapunk. Op.: 96—98 C°, [aß0 =+38° (c = l, etanol). 4. lépés: 60 terc-Butiloxikarbonil-D-a-aminooxi-j3-hidroxipropionsav (BOC-D-OSer) 5,5 g (17,7 mmól) D-a-terc-butiloxikarbonil-ami-65 nooxi-j3-benziloxipropionsavat feloldunk 110 ml me-4
