167360. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mindkét láncvégen alfa-aminooxi-karbonsavat tartalmazó ACTH hatású polipeptidek előállítására
23 167360 24 3. lépés: Tri-Lys(BOC>Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OGly-OBzl 5 7,11g (6,0 mmol) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC> -Lys(BOC>Lys(BOC)-N2H 3 -ot feloldunk 36 ml dimetilformamidban. A-20C°-ra hűtött oldatba keverés közben becsepegtetünk 6 ml (24 mmól) 4n etilacetátos sósav-oldatot, majd 0,84 ml (7,1 mmól) io terc-butilnitritet. A reakcióelegyet 5 percig -10C°-on tartjuk, majd -20C°-ra hűtjük és hozzáadjuk 1,45 g (6,6 mmól) H-OGly-OBzl • HCl-t és 4,24 ml (24,6 mmól) diizopropiletilamin 24 ml dimetilformamidos oldatát. A reakcióelegyet 2 órán 15 át -5 és 0C° közötti hőmérsékleten, majd másnapig 0C°-on tartjuk. Ezután az oldatot bepároljuk, a maradékot vízzel eldörzsöljük, szűrjük, vízzel mossuk. A nyers terméket metanol-víz 1 :1 arányú elegyéből átkristályosítjuk. 6,95 g 20 (87%) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OGly-OBzl-t kapunk. R? = 0,85. 4. lépés: 25 H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC> -Lys(BOC)-OGly-OBzl • HCl 1,87 g (1,4 mmól) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC> 30 -Lys(BOC)-Lys(BOC)-OGly-OBzl-t 37 ml 80%-os vizes ecetsavban oldunk. Az oldatot 1 óra múlva bepároljuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük. Szűrés, éteres mosás, szárítás után a nyers terméket 3,2 x 49 cm-es szilikagéloszlopon etilacetát- 35 -(piridin : ecetsav : víz = 20 : 6 :11) 4:1 arányú elegyével kromatografáljuk. Az elutumot 15 ml-es frakciókban gyűjtjük és összetételüket vékonyrétegkromatográfiával vizsgáljuk. A tiszta terméket tartalmazó 83—97. frakciókat összegyűjtjük és az 40 oldószert ledesztilláljuk, a maradékot éterrel eldörzsöljük, majd szűrés, szárítás után 20 ml metanolban oldjuk és hozzáadunk 0,22 ml piridin és 0,22 ml tömény sósav elegyítésével nyert piridin-hidroklorid-oldatot. Ezután a metanolt ledesztillál- *5 juk, a maradékot éterrel eldörzsöljük, szűrjük, vákuumban szárítjuk. 0,905 g (57%) H-Lys(BOC> -Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OGly-OBzl • HCl-ot kapunk. Rf = 0,23. 50 5. lépés: BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu*> -His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC> 55 -Lys(BOC)-OGly-OBzl • HCl 0,398 g (0,20 mmól) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GluíOBu^-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH • HCl-ot, 0,226 g (0,20 mmól) H-Lys(BOC)-Lys(BOC)- 60 -Lys(BOC)-Lys(BOC)-OGly-OBzl • HCl-t és 0,165 g (0,90 mmól) pentafluorfenolt 4 ml dimetilformamidban feloldunk és 0,022 ml (0,20 mmól) N-metilmorfolint, majd 0,063 g (0,30 mmól) DCC-t adunk hozzá. A reakcióelegyet 16 órán át szoba- 65 hőmérsékleten állni hagyjuk, majd a DCU-t kiszűrjük és a szűrletet éterrel hígítjuk. A kivált terméket szűrjük, éterrel mossuk, vákuumban szárítjuk. 0,502 g (82%) védett nonadekapeptidamid-hidrokloridot kapunk. R? = 0,68. 7. példa Injekciós oldat Összetétel: D-Oser1 , Lys 17 , Lys 18 , OGly 19 -o-i -19-ACTH-OGly19 -NH 2 jégecet nátriumacetát nátriumklorid desztillált vízzel kiegészítve 0,5 mg 1,20 mg 0,60 mg 8,1 mg l,0ml-re. A megadott alkotórészekből injekciós oldatot készítünk, és 1,0 ml-es barna ampullákba töltjük, majd sterilizáljuk. 8. példa Szuszpenziós oldat D-OSe^.Lys17 , Lys 18 , OGly 19 -a»-i9-ACTH-OGly19 -NH 2 cinkklorid nátriumhidrogénfoszfát nátriumklorid benzilalkohol 0,6 n nátriumhidroxid-oldat 8,6 pH-értékig desztillált vízzel kiegészítve 1,0 mg 5,30 mg 1,05 mg 2,00 mg 10,00 mg l,0ml-re. A megadott alkotórészekből ismert módon szuszpenziót készítünk, amely elnyújtott hatást biztosít. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás az (I) általános képletű ACTH-hatásű új polipeptidek H-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly~(Lys)n-X - ebben a képletben n értéke 3 vagy 4, és X -OLys-OH, -D-OLys-OH vagy -OGly-OH csoportot jelent -, (I) valamint savaddíciós sóik, amidjuk és benzilészterük előállítására, azzal jellemezve, hogy az I általános képletnek megfelelő, de legalább a terminális aminooxicsoportján, valamint az oldallánc aminocsoportjain és adott esetben a terminális és az oldallánc karboxilcsoportjain védett peptidről - X és n a fenti jelentésű — a védőcsoportokat lehasítjuk, és kívánt esetben a kapott vegyületet savaddíciós sójává, amidjává vagy benzilészterévé átalakítjuk. 12
