167326. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vízoldható enzimek oldhatatlanná tételére mikrokapszulába vagy gélbe zárás útján
167326 5 -molekulákat inaktiválják a reakcióelegyben levő károsító anyagok. b) Az enzim kisózásához használt só koncentrációjának változtatásával befolyásolni lehet a kialakítandó mikrokapszulák mennyiségét és méretét, 5 illetőleg a gél fizikai paramétereit. c) Lehetővé teszi mikrokapszulába vagy gélbe zárt aktív enzim-preparátum előállítását olyan rendkívül érzékeny enzimekből, így például nyúl- 10 -vázizom-aldolázból és disznó-vázizom-glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenázból is, amelyekből bezárt oldhatatlan aktív enzimet pufferes oldatból még védőanyagok jelenlétében sem lehet előállítani. 15 A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg: 1. példa 20 Aldoláz bezárása nitrocellulóz mikrokapszulába Aldoláz-kristályszuszpenziót állítunk elő Taylor, 25 Green és Cori módszerével [J. Biol. Chem. 173, 591 (1948)]. A továbbiakban ismertetett minden műveletet olvadó jég között vagy hűtőszekrényben végzünk. 30 Az aldoláz-kristályszuszpenziót 0,5 telítettségű ammónium-szulfát-oldattal 0,5—2 mg/ml koncentrációjura hígítjuk. A kapott oldatból 20 ml-t főzőpohárba mérünk, és mágneses keverővel keverjük hab képződését elkerülve, miközben 2—3 35 perc alatt vékony sugárban hozzáadunk 12 ml 2%-os kollódium-oldatot. Ezután az elegyet 20-30 percig tovább keverjük, majd a szerves oldószertől vákuumszűréssel gyorsan megszabadítjuk. Az így előállított mikrokapszulákat 50-100 ml 0,1 mólos, 40 7,5 pH-jú foszfát-pufferrel mossuk, majd kb. 50 ml 10"3 mól/liter 2-merkapto-etanolt tartalmazó foszfát-pufferben 3 órán át inkubáljuk. A mikrokapszulákat inkubálás után 0,1 mólos, 7,5 pH-jú foszfát-pufferrel addig mossuk, amíg a felüluszóban 45 még kimutatható aldoláz, majd desztillált vizes mosás után legfeljebb 20 C° hőmérsékleten liofilizáljuk. A kiindulási aldoláz mennyiségének 0,5-2%-át kapjuk meg aktív formában nitrocellulóz mikro- 50 kapszulába zárva. 2. példa 55 Aldoláz bezárása poliamid mikrokapszulába Az 1. példa szerinti enzim-preparátum 2,5-4 mg/ml koncentrációjú kristály-szuszpenzióját az 1. példában leírt körülmények között keverjük 60 10"3 mól/liter 2-merkapto-etanolt tartalmazó, 0,5 telítettségű ammónium-szulfát-oldatban. 20 ml szuszpenzióhoz 1 perc alatt hozzácsepegtetünk 2 ml 12%-os vizes hexametilén-diamin-oldatot és 20 ml kloroform és ciklohexán 1 :4 arányú 65 elegye vei készített 0,5%-os szebacinsav-diklorid-oldatot olyan módon, hogy a két oldatot egyidejűleg, egymással, arányos mennyiségben juttatjuk a fehérje-szuszpenzióba. Az elegyet 7—8 percen át tovább keverjük, majd a keletkezett polikondenzátumot vákuumszivatással nagyon gyorsan elkülönítjük a folyadékfázistól. A mikrokapszulákat 0,1 mólos. 7,5pH-jú foszfát-pufferrel mossuk, az oldatban maradt fehérje eltávolítása után 10"3 mól/liter 2-merkapto-etanolt tartalmazó foszfát-pufferrel +5 C°-on 3 órán át inkubáljuk, majd ezt követően desztillált vízzel foszfátmentesre mossuk, végül 20 C°-nál nem magasabb hőmérsékleten liofilizáljuk. Ilyen módon az eredeti összes felhasznált enzimre vonatkoztatva 1,5-3%, mikrokapszulába zárt aktív enzimet kapunk. 3. példa D-Glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz bezárása poliamid mikrokapszulába Mindenben a 2. példa szerinti módon járunk el Élődi és Szörényi módszerével [Acta Physiol .Acad. Sei. Hung. 9, 339 (1956)] előállított kristályos D-glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPD) mikrokapszulába zárására, azzal az eltéréssel, hogy kiindulási anyagként 10-15 mg/ml koncentrációjú fehérje-szuszpenziót használunk. Nylon 6 • 10 típusú poliamid mikrokapszulába zárás esetén a hexametilén-diamin-oldattal egyidejűleg itt is szebacinsav-diklorid-oldatot, míg nylon 6 • 6 típusú poliamid mikrokapszulába zárás esetén azonos koncentrációjú adipinsav-diklorid-oldatot adagolunk a fehérje-szuszpenzióhoz, és mosópufferként 0,1 mólos, 8,5 pH-jú olyan glikokoU-puffert használunk, amely 0,1 mól/liter nátriumkloridot és 10"3 mól/liter 2-merkapto-etanolt tartalmaz. A GAPD igen érzékeny enzim, ezért a nyersanyagok szennyeződései jelentős mértékben befolyásolják az aktivitásra számított kitermelést. Gondosan tisztított nyersanyagok használata esetén a kiindulási enzim mennyiségének kb. 1%-os zárható be ilyen módon mikrokapszulába. 4. példa Kataláz bezárása nitrocellulóz mikrokapszulába. Mindenben az 1. példa szerinti módon járunk el, azzal az eltéréssel, hogy enzimként Dounce módszerével [J. Biol. Chem. 143, 497 (1942)] előállított kristályos kataláz közelítőleg 1 mg/ml koncentrációjú, ammónium-szulfátra nézve félig telített szuszpenzióját használjuk. Ilyen módon a felhasznált enzim-mennyiség 1-3 %-át kapjuk meg aktív formában, nitrocellulóz mikiokapszulába zárva. 3
