167326. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vízoldható enzimek oldhatatlanná tételére mikrokapszulába vagy gélbe zárás útján

3 167326 4 módszer hátránya, hogy a kétszeres kezelés hatására az enzim károsodása nagyobb mértékű, mint ha csak bezárást alkalmaznának. Enzim-hiányos betegségek kezelésére és egyéb klinikai célokra mindezideig csak mikrokapszulákba zárt enzimekkel kaptak kielégítő eredményeket (Chang, BiotechnoL Bioeng. Symp. No. 3, 395 /1972/). A mikrokapszulába zárt enzimek ugyanis nem okoznak immunológiai problémákat, és védettek a befogadó szervezet proteolitikus enzimjeivel szemben, sőt már trombusképző hatásúk is kiküszöbölhető (3 522 346 sz. USA-beli szabadalmi leírás). Ez különösen fontossá teszi olyan módszerek kifejlesztését, amelyek segítségével igen érzékeny enzimek is mikrokapszulába zárhatók. Az enzimek mikrokapszulába és gélbe zárása azon alapszik, hogy megfelelő reakció-körülmények mellett előállíthatók, olyan ultravékony hártyák és gélek, amelyek az enzim-molekula számára áthatolhatatlan, de a szubsztrát(ok) és termék(ek) szabadon képes(ek) diffundálni e falon át, így az enzim oldott állapotban van a mikrokapszula vagy a mátrix belsejében, és ki tudja fejteni katalitikus hatását. Mikrokapszulák készítésének két alapvető módszere van: a felületi polikondenzáció és a koacerváció (Chang, Science 146, 524 (1963), Luzzi, Zoglio és Maulding, J. Pharm. Sei. 41, 338, (1959)). Mindkét módszer szerint az oldott enzimet zárják be ultravékony szemipermeábilis membrán által határolt mikrokapszulába, melynek mérete az előállítás körülményeitől és az adalékanyagoktól függően 35-200Á. Ezzel a módszerrel zártak be ureázt, katalázt és aszparaginázt. Egy módosított eljárás szerint szérum-albumin jelenlétében végzik szénsavanhidratáz enzim mikrokapszulába zárását [Boguslasky és Janik, Biochem. Biophys. Acta 250, 266 (1971)]. Gélbe zárásra legelterjedtebben poliakrilamidot használnak [Mosbach és Mosbach, Acta Chem. Scan. 20, 2807 (1966)] olyan módon, hogy a fehérje oldatához akrilamid és N,N'-metilén-biszakrilamid monomereket, majd megfelelő iniciátort adnak, és így az enzimet bezárva tartalmazó poliakrilamid gélhez jutnak. Más polimerbe való bezárásra ismertet példát a 7 304 330 számú holland szabadalmi bejelentés, amely szerint az enzimet telítetlen dikarbonsavak anhidridjeiből és di- vagy polialkoholok poli(met)akrilátjaiból statisztikus módon felépített kopolimerizátumba zárják be. A 7 304 331 a keletkezett preparátum tulajdonságainak megjavítása céljából. Egyes esetekben szükség lehet arra, hogy az előállított vízoldhatatlan preparátumnak a felhasználás igényei szerint más alakot adjanak. így például a 795 316 számú belga szabadalmi leírás szerint keresztkötésekkel rendelkező hidrofil polimerbe zárt enzimkészítményt feloldanak szerves oldószerben, majd az így kapott oldatot vékonyréteggé öntik. Az így előállított termék nagyobb stabilitással rendelkezik, mint az eredeti enzim, azonban a szerves oldószerben való feloldás károsító hatású. Kísérleteink során megállapítottuk, hogy mind a polikondenzációs, mind a alkalmazott reakciókörülmények gátolják a legtöbb enzim működését. Koacerváció esetén a szerves fázis jelenléte és az 5 intenzív keverés, polikondenzáció esetén pedig az előbbi két tényezőn kívül a vizes fázis erős lugossága és a felhasznált savkloridok, továbbá mindkét módszer esetében a keletkező szabad gyökök is gátolják az érzékeny enzimek így 10 például a nyul-vázizom-aldoláz és a disznó-vázizom•^licerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz működését. A találmány célja olyan eljárás kidolgozása, amely egyszerű és gazdaságos módon teszi lehetővé vízoldható enzimek mikrokapszulába vagy gélbe 15 zárását - és így közvetve vízoldhatatlanná tételét -az enzim aktivitásának az eddig ismert eljárások esetében föllépőnél lényegesen kisebb mértékű csökkenése mellett. A találmány további célja olyan enzimek bezárásának lehetővé tétele, 20 amelyek nagy érzékenységük miatt eddig nem voltak bezárhatok. A találmány alapja az a felismerés, hogy a felületi polikondenzációval kialakított poliamidból vagy koacervációval kialakított nitrocellulózból 25 készült mikrokapszulába vagy polimerizációval kialakított poliakrilamid gélbe zárt enzim aktivitása lényegesen kisebb mértékben csökken, ha a dehidrogenázok, acilázok, aldolázok vagy peroxidázok csoportjába tartozó vízoldható enzim mikro-30 kapszulába vagy gélbe zárását nem közvetlenül oldatból végezzük, hanem az enzimet előzőleg kicsapjuk az oldatból kristály vagy aggregátum formájában. A fentieknek megfelelően a találmány eljárás a 35 dehidrogenázok, acilázok, aldolázok vagy peroxidázok csoportjába tartozó vízoldható enzimek oldhatatlanná tételére, az enzimek felületi polikondenzációval kialakított poliamidból vagy koacervációval kialakított nitrocellulózból készült mikro-40 kapszulába vagy polimerizációval kialakított poliakrilamid gélbe zárása útján. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a dehidrogenázok, acilázok, aldolázok vagy peroxidázok csoportjába tartozó enzim vizes oldatából kisózással vagy 45 kicsapással vizes kristály- vagy aggregátum-szuszpenziót készítünk, és ezt a szuszpenziót mikrokapszulába vagy gélbe zárjuk. Különösen előnyösnek találtuk kristályszuszpenzió alkalmazását. A találmány értelmében „.enzimek" kifejezésen 50 mind egyes enzimeket, mind enzim-rendszereket értünk. Az enzim kisózását ammónium-szulfáttal vagy alkálifém-szulfáttal, előnyösen nátrium-szulfáttal végezhetjük. 55 Az enzim kicsapását vízzel elegyedő szerves oldószerrel, célszerűen 1—3 szénatomot tartalmazó alkohollal, vagy legfeljebb 4 szénatomot tartalmazó ketonnal, előnyösen etanollal végezhetjük 0C° alatti, előnyösen 0 C° és -5 C° közötti hőmérsék-60 léten. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következőek: a) Segítségével kiküszöbölhető, hogy az enzim-65 kristály vagy -aggregátum belsejében levő enzim-2