167271. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az aminocsoporton alkiniloxi-karbonil-csoporttal védett aminosavak és peptidek előállítására
167271 31 32 37. példa A glükagon 22—26 fragmentjének előállítása a következőképpen történik: 14,68 g (21,2 mmól) N-karbobenzoxi-L-valil-L-glutaminil-L-triptotil-L-leucin-metilészter 600 ml 50%-os vizes dioxánnal készített oldatához 21,2 ml (42,4 mmól) 2 n nátriumhidroxid-oldatot adunk és az oldatot 17 órán keresztül keverjük, hogy a metilészter szappanosodása végbemenjen. Ezután a reakcióelegyet 21,2 ml 1 n sósav hozzáadásával pH = 5,3 értékre savanyítjuk. Ezután az elegy pH-ját 10%-os citromsav-oldattal 3,5 értékre állítjuk be. A reakcióelegyet felhígítjuk keverés közben 100 ml vízzel és a híg elegyet néhány órán át 4 °C-on tároljuk. A reakcióterméket szűrjük és vízzel mossuk, majd káliumhidroxid felett szárítjuk. A vékonyrétegkromatogram szilikagél lemezen 1 foltot mutatott (klórtoluidin), Rf-érték: 0,56 kloroform: :n-butanol :ecetsav :víz 75:24:12:2). A termék NMR-spektruma az O-metil-rezonancia távollétét jelezte 3,6 ppm értéken dimetilszulfoxidban. Az elszappanosított karbobenzoxi-tetrapeptidet 300 ml dimetilformamidban feloldjuk ós szobahőmérsékleten 5 órán keresztül hidrogénezzük 2,0 g szénre felvitt 5%-os palládium felett. A katalizátort kiszűrjük és a szűrletet vákuumban bepároljuk, így 8,66 g (75,2%) L-valil-L-glutaminil-L-triptofíl-L-leucint kapunk gumiszerű maradék alakjában-A vékonyrétegkromatogram szilikagélen 1 foltot mutatott, Rf-érték: 0,37 (éter :metanol :víz 75:24 :1). Az MMR-spektrum a karbobenzoxi-csoportra jellemző rezonancia távollétét jelezte. A tetrapeptid savas hidrolizátumának kvantitatív aminosav analízise: Glu (1,0), Leu (1,07), Val (0,96). A fenti módon kapott 6,93 g (12,73 mmól) L-valil-L-glutaminil-L-triptofil-L-leucin és 5,39 g (14,01 mmól) N-(3-metil-l-butin-3-oxikarbonil)-L-fenilalanin-N-hidroxiszukcinimidészter 100 ml dimetilformamiddal készített elegyét 5 órán keresztül 0 °C-on keverjük, majd szobahőmérsékleten hagyjuk melegedni. Ezután 90 órán át keverjük, majd vákuumban körülbelül 20 ml térfogatra bepároljuk. Éter hozzáadása után a reakcióterméket, N-(3-metil-l-butin-3-oxikarbonil)-L-fenilalanil-L-valil-L-glutaminil-L-triptofil-L-leucint szilárd csapadék alakjában kapjuk (8,48 g, 83%), amely körülbelül 170—175 °C-on olvad. A peptid-terméket forró metanol—víz elegyből kristályosítjuk és káliumhidroxid felett szárítjuk, így 3,3 g (33%) terméket kapunk körülbelül 207—209 °C olvadásponttal. Vékonyrétegkromatogram: 1 folt (klórtoluidin), Rf-érték: 0,44 (kloroformmetanol-ecetsav 25:24:1) és Rf-érték: 0,186 (tetrahidrofurán:ciklohexán:víz 94:7:5). A termék MMR-spektruma dimetilszulfoxidban d 0,84 [M, 14, —CH3 (valin és leucin) ^ = CH— (valin) 7 = CH—leucin), d 1,5 [S, ß—CH2 (leucin)] d 1,53 (S,'6, —C= C—C(CH3 ) 2 ), ő 3,3 I I ! (S,. = C—C—H), C 10,78 [S, indolNH, (triptofán)]. ! I ! , A savas hidrolizátum kvantitatív aminosavanalízise: Glu (1,0), Leu (1,04), Val (0,97), Phe (0,96). Elemzési eredmények a C42 H 55 N 7 0 9 képlet alapján: számított: C% 62,91, H% 6,91, N% 12,23, 0% 17,95; talált: C% 62,72, H% 7,00, N% 12,23, 0% 18,20. 5 38. példa A 37. példa szerinti N-védett peptid hidroklorid-sóját (3,21 g 4 mmól) feloldjuk 10 ml dimetilformamidban és az oldatot keverés közben hozzáadjuk 10 2,57 g (5 mmól) L-metionil-L-aszparaginil-L-treonin-di-O-terc-butilészter és 0,55 ml (5 mmól) N-metilmorfolin 40 ml dimetilformamiddal készített 0 °C hőmérsékletű oldatához. A kevert és körülbelül 0 °C hőmérsékleten tartott reakcióelegyhez hozzá-15 adjuk 0,69 (6 mmól) N-hidroxi-szukcinimid 5 ml dimetilformamiddal készített oldatát és 0,824 g (4 mmól) diciklohexil-karbodiimid 5 ml dimetilformamiddal készített oldatát. A reakcióelegyet 2 órán át 0 °C-on és 64 órán keresztül szobahőmér-20 sékleten keverjük. Ezután az elegyet 0 °C-ra hűtjük néhány órőn át és a kívánt diciklohexilkarbamidot szűrjük. A szűrletet vákuumban kis térfogatra bepároljuk és etilacetáttal felhígítjuk. A híg reakcióelegyet néhány órán át 4 °C-on állni hagyjuk és 25 a kivált terméket szűrjük, ezután éterrel, majd vízzel mossuk és káliumhidroxid felett szárítjuk. így 4,38 g (87%) N-(3-metil-l-butin-3-oxi-karbonil)-L-fenilalanil-L-glutaminü-L-triptofil-L-leucil-L-metionil-L-aszparaginil-L-treonin-di-O-terc-butilész-30 tért kapunk, amely körülbelül 221—225 °C-on olvad (bomlás). Vékonyrétegkromatogram: 1 folt (klórtoluidin), Rf-érték: 0,88 (kloroform :metanol :ecetsav 75:24:1). A termék savas hidrolizátumának kvantitatív aminosav analízise: Asp (1,0, Thr (0,95), 35 Glu (0,99), Val (0,99), Met (0,97), Leu (1,03) és Phe (0,99). Elemzési eredmények a CggHggNLjO^S képlet alapján: számított: 40 C% 60,03, H%7,44, N% 12,22, 0% 17,77, S% 2,54; talált: C% 59,87, H% 7,26, N% 12,25, 0% 18,04, S% 2,44. 45 39. példa A 38. példa reakciótermékét (MBOC-L-Phen-L-Val-L-Gln-L-Trp-L-Leu-L-Met-L-Asp-L-Thr-di-O-terc-butil-L-Thr) feloldjuk 75 ml dimetilforma-50 midban és szobahőmérsékleten 1,19 g, szénre felvitt 5%-os palládium jelenlétében hidrogénezzük. A hidrogenolízist oly módon követjük, hogy a fejlődött széndioxidot báriumhidroxidban felfogjuk. A hidrogenolízis körülbelül 1,5 óra alatt befejeződik, de 55 3 órán át folytatjuk. A katalizátort kiszűrjük és a szűrletet szénnel derítjük. A derített reakcióelegyet vákuumban bepároljuk. A maradékot dimetilformamidban feloldjuk és a terméket víz cseppenkénti hozzáadásával kicsapjuk. Ezután a terméket szűr-60 jük és vízzel mossuk, majd éjszakán át/vákuumban szárítjuk. így 1,77 g (64,7%) terméket kapunk, amely körülbelül 239—240,5 °C-on olvad (bomlás). Vékonyrétegkromatogram: 1 folt, Rf-érték: 0,29 (kloroform :metanol:ecetsav 75:24:1). A termék sa-65 vas hidrolizátumának kvantitatív aminosav analí-16
