167266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás S-adenozil-L-metionin- tri-p-toluolszulfonát és e vegyületét hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
167 266 3 4 szulfonát stabilitásával. A táblázat számai az el nem bomlott SAM %-os mennyiségét jelentik. 1. táblázat Anion 30 nap 180 nap 360 nap 540 nap klorid 65 — — — szulfát 91,7 61,0 — — tri-p-toluol-szulfonát 98,5 92,2 84,2 80,1 Az új sót a találmány szerint lényegében az alábbi lépésekben állítjuk elő: a) Metionin megfelelő körülmények között való hozzáadásával [Schlenk, Enzymológia 29, 283 (1965)] SAM-mal dúsított élesztőt (Saccharomyces cerevisiae, Torulopsis utilis, Candida utilis stb.) a környezet hőmérsékletén etilacetáttal vagy metilacetáttal kezelünk. Ekkor a sejtek felhasadnak és bennük levő SAM 100%-a az oldatba kerül. b) A szűrt vizes oldatot savformájú gyenge kationcserélő műgyantával töltött oszlopon adszorbeáltatjuk. c) A szennyezéseket vizes, majd 25 mmólos ecetsavas mosással eltávolítjuk. d) A SAM-ot szelektíven eluáljuk p-toluolszulfonsav vizes oldatával. e) A feleslegben maradt p-toluolszulfonsavat hidroxil-formájú erős vagy gyenge anionos gyantán való kezeléssel semlegesítjük, míg a p-toluolszulfonsav-SAM mólarány 3 és 10 közötti értéket, előnyösen 6 körüli értéket ér el. f) Az oldatot vákuumban szobahőmérsékleten betöményítjük vagy liofilizáljuk, míg annak térfogata az eredeti térfogat 2—4 huszad részére, előnyösen 3/20 részére csökken. g) A betöményített oldathoz egy vízzel elegyedő oldószert, pl. etanolt, propanolt, izopropanolt, acetont vagy metiletilketont adunk. Ekkor kicsapódik a gyakorlatilag tiszta SAM-C^H^SgOg só. Az a) lépésben a nedves sejtek súlyára számítva 1/20—1/5 súlyrész, előnyösén 1/10 súlyrész etilvagy metil-acetatot használunk, és a sejtek bontását 30 perc és 2 óra közötti ideig, előnyösen 1 órán át folytatjuk. Meg kell jegyeznünk, hogy az élesztősejtek szerves oldószerekkel való bontása a találmány szerinti eljárás szempontjából sokkal előnyösebb, mint a szokásosan alkalmazott, 60 °C-on végzett perklórsavas, hangyasavas vagy ecetsavas vagy más hasonló bontás. Ily módon ugyanis elkerülhetjük a magas hőmérsékletet, amely csökkenti a SAM stabilitását, különösen a bontáshoz használt savak pH viszonyai között. Az erős savak használatának elkerülésével lehetővé vált, hogy a következő lépésben gyenge kationos gyantát használjunk kis térfogatban. Ugyanakkor a korrózió veszélye nélkül használhatjuk a szokásos berendezéseket. További előny, hogy a fehérjék szerves oldószeres denaturálása következtében a sejtmaradékot könynyebben lehet szűrni. A b) lépést előnyösen egy gyengén savas kationcserélő műgyantával pl. hidrogén formájú Amberlite IRC—50, Permutit Q210, Zeo-Karb 226 vagy Dewex CCR1 műgyantával töltött oszlopon végezzük. 5 Ad) lépést olyan vizes p-toluolszulfonsav oldattal hajtjuk végre, amelynek koncentrációja 1 mólig terjedhet. Ez nagy előnyt jelent az oldat későbbi betöményítése során. 10 Az e) lépésben a p-toluolszulfonsav fölöslegének semlegesítéséhez különösen hatásosnak találtuk az erősen bázikus, kvaterner ammónium-csoportot tartalmazó anioncserélő műgyantákat, így az Amberlite IRA 900, a Deacidit FF és a Duolit A 101D 15 jelzésű anioncserélő műgyantákat. A p-toluolszulfonsavnak a SAM-hoz viszonyított végső aránya kritikus a SAM p-toluolszulfonát kicsapása szempontjából. A kicsapás során valamennyi szervetlen kationos só az oldatban marad 20 az esetleg jelenlevő kismennyiségű szennyezéssel együtt, míg a só teljes egészében a csapadékba kerül. A SAM-C21 H 23 S" 3 O fl előállításának találmány szerinti lehetséges módszerei közül a fentiekben a legelőnyösebbet írtuk le, amely a legjobb ered-25 ményt biztosítja. Néhány jó eredménnyel járó változatot a későbbiekben említünk, míg a további eljárás változatok megvalósítása nyilvánvaló a szakember számára. Először is magától értetődő, hogy a SAM tri-p-30 -toluolszulfonátot ki lehet csapni bármilyen vizes oldatból, amely SAM-ot tartalmaz. Ez lehet például egy olyan oldat, mely a SAM enzimes vagy kémiai szintéziséből származik vagy a vegyület egy oldható sójának vizes oldata. Ily módon azonban minden 35 esetben kevésbé tiszta terméket kapunk, és a hozam is kisebb. Az eljárás további változata abban áll, hogy a gyenge kationos műgyantára adszorbeált SAM-ot p-toluolszulfonsav helyett sósav vagy kénsav vizes 40 oldatával távolíthatjuk el az eluátumból, oly módon, hogy a gyantához a fenti kedvező arány alapján számított mennyiségben p-toluolszulfonsavat adunk és így kicsapjuk a tri-p-toluolszulfonátot. Más módon eljárva a szennyezett SAM kloridját 45 vagy szulfátját csaphatjuk ki az eluátumból, miután a feleslegben levő savat desztillációval vagy egy megfelelő bázissal való keveréssel eltávolítottuk. Az így kicsapott szulfátot vagy kloridot újra oldjuk vízben, majd az anion eltávolítása és az említett 50 arány alapján számított mennyiségű p-toluolszulfonsav hozzáadása után a SAM tri-p-toluolszulfonátját kicsapjuk. A SAM eluálásához más erős savat is használhatunk hasonló módon, ennek azonban különösebb előnye nincs. 55 A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg közelebbről az oltalmi kör korlátozása nélkül. 1. példa 60 SAM-mal dúsított élesztő 90 kg-jához, amely kgonként 5,5 g SAM-ot tartalmaz, [Schlenk Enzymológia 29, 283 (1965)] 9 liter etilacetátot adunk szobahőmérsékleten. 1 órán át tartó erőteljes keverés vagy rázás Után a sejttömeget 40 kg vízzel hí-65 gítjuk, azután szűrjük és mossuk. 140 liter oldatot 2
